Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
пептидаза HLeuOH+NH„С1 1 ,8-10-3 1 ,2-10-3
4 3,5-10-3
НЪеиОН+НЪеиИН(CH2)20H
Карбоксипептидаза А AcPheOH 3,3-Ю~б 9,9 -10_б
AcPheOH+HPheOH 11 ,6-10“б
‘Вычислено по формуле (1) в работе [2188] ¦
Таким образом, у сериновых протеаз каталитически активная гидроксильная группа Ser195 является группой, атакующей расщепляемую связь амидных и эфирных субстратов. То же самое справедливо и для SK-группы остатка Сув25 цистеиновых ферментов.
Атакующим нуклеофилом в случае аспартатных протеаз является молекула воды. Нуклеофильные каталитические группы этих ферментов выступают в качестве общих основных катализаторов, способствуя отщеплению протона от молекулы воды. Следует отметить, однако, что результаты опытов по включению 180 в продукт транспептидации, катализируемой пепсином, ставились под сомнение [32401 и объяснялись сложной последовательностью реакций синтеза-гидролиза. Несмотря на это, общий основной катализ на стадии нуклеофильной атаки является в настоящее время общепризнанным.
В отношении карбоксипептидазы А, несмотря на многочисленные данные в пользу общего основного катализа атаки водой, связанной с ионом Zn2+, при гидролизе как амидных, так и гфирных субстратов [3241-32441, приводятся аргументы, основанные, главным образом, на данных криоэнзимологии (см. разд.
5.7), в пользу промежуточного образования ангидрида между ацильным фрагментом субстрата и карбоксильной группой остатка Glu270 [2523,3206,3245-3248]. Для лейцинаминопептидазы и термолизина [26951 сомнений в общем основном катализе не возникает.
Для аминопептидазы М было постулировано участие фенольной оксигруппы ти-розинового остатка в качестве нуклеофила, непосредственно атакуюшчго субстратный карбонил и образующего с ацильным фрагментом субстрата сложноэфирную связь (ацилфермент) [32491.
Были получены данные, указывающие на ковалентный катализ при гидролизе пепсином сульфидных эфиров [3221,3250,3251], однако они нуждаются в проверке.
Следует отметить, что участие карбоксильной группы в качестве ковалентного катализатора представляемся мне маловероятным. Хотя имеются модели, где карбоксилрт-Еон выполняет именно эту функцию (см. разд.3.4.5), такие случаи ограничены образованием относительно устойчивых циклические ангидридов. Сравнение тетраэдрических промежуточных соедиьечий, образованных карбоксильной группой и гидроксил-ионом, показывает, что- тзаспад первых в направлении исходных соединений должен быть значительно более эффективным (низкая основность СОСГ-группы), чем во втором случае:
OR OR
Е-Л-0-i-u” Е-И-ОН-НО-^-О'
Жни’ Ahr*
7.5 Слектрсфил
Одним из способов увеличения реакционной способности производных карбоновых кислот в гидролитических реакциях является электрофильный катализ. Этот тип катализа направлен на атом кислорода карбонильной группы и вызывает перераспределение электронной плотности тек, что плложит- яьный заряд на атоме углерода увеличивается:
Ч
-С— N11—
В случае сериновых протеаз, как уже отмечалось (см_разд.6.5^3), карбонильный кислород в фермент-суiJcтратном комплексе занимает место в так называемом оксианионном кармане, образуя водородные связи с NH-группой Gly193
о о
(«2,8 А в химотрипсине) и NH-группой Ser195 (3,2 А).
Сами по себе такие водородные связи не могут эффективно поляризовать карбонильную группу субстрата. Квантово-химические расчеты показал*., что заряды на атомах амидной группы практически не меняются при образовании водородной связи карбонильным кислородом. Лишь протонирование карбонильного кислорода существенно изменяет заряды на атома? С, N и О, а также порядки связей С-0 и C-N [3252].
Роль этих связей возрастает при образовании промежуточного тетраэдрического соединения, в котором карбонильный кислород приобретает целый отрицательный заряд. Появление заряда в неполярном окружении активного центра фермента крайне невыгодно. Однако наличие двух диполей N-Н вблизи заряда значительно компенсирует эти энергвтпшские потери [3253-32571-
Предполагалось, что аналогичную роль у цистеиновых протеаз играют NH-группа Сув25 и амидная группа боковой цепи остатка Gln19 [3258]. Следует, однако, отметить, что сравнение скоростей гидролиза кислородных [RC(-0)0R'l и тионовых [RC(-S)0R4 эфиров сериновыми и цистеиновыми амидгидролазами [3259, 3260] ставит под сочнения роль этих вваимодействий в стабилизации тетраэдрического промежуточного соединения цистеиновыми ферментами. В то время, как сериновые протеазы не способны гидролизовать тионовые эфиры из-за разменов атома серы, не позволяющего тиокарбонилыюй группе правильно разместиться в оксианионжЛ полости, цистеиновые ферменть- одинаково хорошо гидролизуют оба типа эфиров.
