Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
По тем же . причинам в случае механизма (1) не следует ожидать включения 180 из Н180 в продукты ацыыюго переноса или транспептидацш*, а если реакция идет по механизму (2), то такое вклшение должно наблюдаться. В табл.75
ТабЛИЦР 75. Включение 180 в прадоп ть транспептидашп- [2040,3229,3230]
Фермент Исследуемая реакция Форма анали Обмен, %
зируемого
продукта*
Химотрипсин 2LeuLeuNH2 ---»(Leu)3+LeuNH2+NH3 Tfa(Leu)30Me 0
Папаин ZGlyNH2+LeuGly ---•ZGlyLeuGly+NH3 ZGlyLeuGlyOMe 0
Карбоксипеп ZGlyOMe+LeuGly --->ZGlyLeuGly+MeOH ZGlyLeuGlyOMe 0
тидаза Y ZPheOMe+HLeuNH2 ---ZFheLeuHHg+MeO ZPheLeuMHg 0
Пепсин ZPheAlaOH+HLeuMHg ---ZPheLeuKHg+Ala 1ZPheLeuNHg 0
Лейцинамино- 2LeuTyrNH2 ---»(Leu)2+2TyrNH2 TMS(Leu)gOTMS 56±10
пептидаза 2LeuNH2 --->LeuXeuNH2'-NH3 LeuLeuNHg 46±5
Термолизин 2LeuLeuUH2 ---> (Leu)g+?TeuMHg 180-LeuI.eulJH2 Cl- с **
*Tfa - тр гфторацетил, TMS - тркметилсилил; Tfa(Leu)?0Me 55±5
вещества исследованы масс-спектгометрическ ных % lt3o 47±5
Использо валг-сь вода, содержащая 60-80 атом
**Использо вался 180-LeuHH„ и Ь 16П.
приведены данные, полученные [2040,2189,2574.3227-3232] при исследовании этим методом гидролиза, катализируемого различными амидгидролазами. Все эти результаты показывают, что сериновые и цистеиновые протеазы функционируют по типу ковалентного (1), а аспартатные и металлсодержащие протеазы - по типу общего основного (2) катализа на стадии атаки субстрата молекулой воды.
Уже давно было показано (разд.4.8.2), что многие амидгидролазы катализируют обмен кислорода в ацильном продукте гидролитической реакции. Само это обстоятельство некоторые авторы [2183,3233,3234] склонны рассматривать как свидетельство образования ацилфермента, другие же [2188] считают, что этот обмен может быть следствием синтеза (из ациламинокислоты и пептидов - продуктов автолиза или отщепления ацильной группы) нового пептида и последующего его гидролиза. На самом деле такие ферменты, как пепсин и лейцинамино-пептидаза, функционирующие по механизму (2), способны катализировать 180-обмен в ацилфенилаланине и лейцине:
Как видно из схемы, добавление аминного продукта реакции (f^NHg) должно увеличивать скорость обмена 1е0 в ацильном продукте лишь в случае, если реакция идет по механизму (2), за счет параллельно протекающзго процесса синтеза-гидролиза пептида. Как видно из данных табл.76, катализ пепсином, лей-цинаминопептидазой и карбоксипептидазой А идет именно по этому механизму.
Очевидно, что вклад синтеза-гидролиза может быть заметным, лишь если его суммарная скорость сравнима со скоростью собственного обмена. Это видно на примере системы HLeuOH + NH Cl, где ускорение аммиаком не превышает ошибки опыта, поскольку скорость синтеза-гидролиза весьма низкая.
Все эти методы позволяют судить о наличии или отсутствии ацилфермента, но для сувдения о промежуточном образовании "аминофермента" (E-C0NHR) они непригодны.
Для этого необходимо убедится в отсутствии включения 180 в карбоксильные группы активного цетра фермента, которое должно происходить при гидролизе аминофермента:
ОН ОН
ОН
NHR,
NHR,
E-C0*NHR1 + Н*0
Е-С0*0Н + NH2R1.
Отрицательные результаты в отношении включения метки в фермент в ходе гидролиза субстратов пепсином были получены при анализе продуктов, получающихся при мягком гидролизе специфически ингибированного фермента [2189,
25743:
* 1 * 1 он * 1
Е-СО ОН + N2CHCOR1 ------»- E-CO OCH2COR1 ------->- Е-СООН + H*0CH2C0R1,
а также методом прямого масс-спектрометрирования фрагментов пепсина и кар-Ооксипептидазы А после их инкубации в Н280 в присутствии субстратов [32361.
Сходные методы были использованы для выяснения механизма действия амино-ацилазы из почек свиньи [32371, аспарагиназы [32381, а также ферментов других классов [32391-
Таблица 76. Скорость обмена кислорода, катализируемого пепсином, лейцинаминопептидазой и карбоксипептидазой А [2189,3228,3235]
Фермент Субстрат Эксперимен Вычисленное
тальное зна значение ско
чение V, рости обмена
обмена, за счет
М.мин-1 синтеза-
-гидролиза ,
М-мин-1
Пепсин AcPheOH 2,5-10-5 _
AcPheOH+HPhe(Ala)ОМе 5,6*10-5 7,8-10-5
Лейцинамино- HLeuOH 1 ,6-10“3 8,3-10_б
