Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Антонов В.К. -> "Химия протеолиза " -> 162

Химия протеолиза - Антонов В.К.

Антонов В.К. Химия протеолиза — М.: Наука, 1991. — 504 c.
Скачать (прямая ссылка): himiyaprotezana1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 156 157 158 159 160 161 < 162 > 163 164 165 166 167 168 .. 278 >> Следующая

Е + RC0XR1 -В— E-RC0XR1 —
------------* Е + RCOYR2 + R1XH
ft3[HYR2]
ft . fto[Ho0] + ft [HYR2]
cat 2 2 3
Хорошим нуклеофилом для таких измерений является 1,4-бутандиол [1723].
Этот способ был успешно применен для идентификации ацилфермента при гидролизе эфиров бензоилглицина химотрипсином (HYR2 - гидроксиламин) [3198, 3212], однако его использование для доказательства образования ацилфермента при гидролизе амидов ациламинокислот химотрипсином натолкнулось на определенные трудности (ср.[3213] и [3214]). Лишь в 1973 г. этим методом были получены [1412] однозначные данные в пользу образования ацилфермента при хи-мотрипсиновом гидролизе амидов. Эти же методы были использованы для доказательства промежуточного образования ацилферментов при катализе (3-лактамазой [1856], Р-аланилкарбоксипептидазой [2180,3215] и катепсином В [3216]. Для идентификации лимитирующей скорость стадии было также предложено [3217]
определять температурную зависимость k и k ./К . Эти две величины оди-
ойх Сйъ m
каково изменяются с температурой, если медленной стадией является ацилиро-вание фермента.
Использование метода "перехвата" и, в частности, его разновидности - реакции транспептидации [2169,2177,3218-3221 ], привело исследователей к убеж-дению о существовании "ацилфермента" (ангидрида Е-CO-O-COR) и "аминофермен-та" (E-CONHR1) при гидролизе пептидов пепсином и другими аспартатными про-теазами. Образование "аминофермента" подтверждалось также исследованием начальных скоростей транспептидации субстратов, имеющих одинаковую переносимую группу (см. разд.4.8.1). В дальнейшем было показано, что такие ковалентные промежуточные соединения при катализе пепсином не образуются. Следовательно, метод "перехвата" не всегда способен различить ковалентные и устойчивые нековалентные промежуточные соединения.
Еще один способ, имеющий, впрочем, тот же недостаток, основан на изучении упорядоченности отщепления продуктов гидролитической реакции по характеру ингибирования продуктами (см. разд,5.8.3). Этот метод использовался [2175,2587,2604] для анализа механизма дййствия пепсина, однако полученные результаты были подвергнуты критике [2588].
Предпринимались также попытн и вынести суждение об образовании ковалентных промежуточных соединений на основе соотношений линейности свободных энергий [2010,2012,2013]. Такой анализ ограничивается системами, для которых известны стандартные изменения свободной энергии, и несвободен от ряда произвольных допущений.
Наконец, изучение влияния модификации фермента на амидазную и эстеразную активности может дать информацию о сходстве или различиях в механизмах гидролиза амидов и эфиров. Однако и этот метод дает далеко не однозначные результаты (ср. [3222] И [32231).
На мой взгляд, наиболее надежными методами установления типа катализа являются методы, основанные на изучении включения тяжелого кислорода из Н^8С в субстрат, продукт транспеггидации иш продукт гидролиза.
Действительно, механизмы (1) и (2) отличаются тем, что в первом случае вода участвует в реакции на стадии гидролиза ацилфермента, а во втором - на первой химической стадии процесса, важным условием является то, что реакция идет по механизму ацилкислородного расщепления, установленного для модельных систем (см. разд.3.3) и для гидролиза эфиров некоторыми протеазами [32241.
Включение 180 в субстрат можно изучать как в стационарном режиме [3225-3228], так и в условиях равновесия [17291 - В первом случае метка 1е0 может включаться в субстрат, лишь если вода участвует на первой химической стадии реакции, т.е. реакция идет по механизму (2). Здесь положительный результат свидетельствует о механизме (2), но отрицательный - не дает оснований для выводов, поскольку отсутствие включения в субстрат может быть следствием неблагоприятного соотношения скоростей образования (fe?) и распада (&3) промежуточного тетраэдричэского соединения:
ft.

продукты.
Если реакция идет через образование ацилфр.рмента и система находится в термодинамическом равновесии:
Н*0
Е + RCONHR1 ' Е- RCONHR1*— Е-COR Е + RCO*OH,
+
R1NH2
то скорость включения 1е0 в субстрат из Н^80 не может превышать скорости включения в субстрат ацильного продукта реакции, а скорость включения R'NIIg может быть существенно выше этой величины, так как последнее происходит независимо от включения 1е0.
Если же реакция идет без образования ацилфермента:
Е + Н*0 + RCONHR1 Е-RCONHR1 -Н*0 E-RCO*OH Е + RCO*OH,
+
r1nh2
то включение 1е0 в субстрат должно происходить с такой же скоростью, с какой включается R'NH2. Используя радиоактивные продукты реакции и измеряя скорость включения радиоактивных меток и 180 из тяже»вокислородной воды в субстрат при различных, но равновесных концентрациях субстрата и продуктов (метод Бойера, см. разд.4.5.1), было показано [1729-1731], что в ходе гидролиза A'VPheGlyNHg, катализируемого "имотрипсином, реализуется первая из рассмотренных возможностей, т.е. реакция идет через ацилфермент.
Предыдущая << 1 .. 156 157 158 159 160 161 < 162 > 163 164 165 166 167 168 .. 278 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed