Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
мы в рН„„т источник
* опт
-CH?0H Химотрипсин и др. м13,5 8,0 3,2-10 6 [1527]
-CHgSH Папаин 4,1 * 6,0 0,99 [2345]
Химспапаин А 6,8 7,2 0,71 [3153]
~П Химотрипсин 6,8 8,0 0,06 [3160]
Ч-да Трипсин свиньи 5,0 8,0 1 .10“3 [3160]
а-Литическая 5,7 8,0 5 -10_3 [3160]
протеаза
Папаин 4,2Ь* 6,0 2 -10 2 [3169]
Термолизин 7,8 8,0 0,39 [1527,2329]
-соон а-Литическая 4,5 8,0 1 [2350]
протеаза (Авр102)
Папаин (Авр158) 4,2 6,0 •0,98 [3150]
Пепсин (Asp32) 1,5 2,5 0,91 [2324,3170]
(Авр215) 4,7 2,5 6,3-1 о-3 [2324,3170]
Карбоксипепти 6,0 8,0 0,99 13171 ]
даза A (Glu270)
Термолизин (Glu166) 6,2 8,0 0,98 [1527]
Zn2t..0Н2 Карбоксипепти «7 8,0 0,9 [1566]
даза А
Термолизин *>7 8,0 0,9 [1566]
C0NH Все ферменты «18** [71 ]
’’'Значения ркаталитических групп папаина сильно зависят от pH и
состояния SH-группы.
‘"’"Для ионизации C0NH ^- ~ CON” + Н+.
20. В.К. Антонов
удается, поскольку титровать белки до значений рН«14 невозможно. Указанное в таблице значение рКа приписывается этому остатку на основании значений рйа гидроксильной группы в N-ацетилсериламиде. Одно время полагали [3166], что значение рКа серинового гидроксила может быть значительно меньше (<«8) за счет соседства с положительно заряженными группами, например аргинина. Однако кристаллографические данные не подтвердили это предположение.
Довольно сложным является состояние ионизации остатков Сув25 и His159 в папаине и некоторых других родственных цистеиновых ферментах. Значение рХа каждой из этих групп зависит от состояния ионизации другой группы. Предполагается, что в папаине существует следующая система прототропных равнове-
СИЙ: Im~Е—SH -^12
ImH— Е— SH Im—E-
ImH—E—S
ImH—E—S
с pK1 4,26; pK2 3,34; pK12 7,ББ и pif?1 8,47. Это, по-видимому, обусловлено существованием двух pH-зависимых конформационных состояний фермента (см. разд.Б.2.3.) и, вероятно, является следствием влияния электростатического поля, создаваемого группой с рй& 5-6, удаленной от каталитического центра [3167]. У папаина ионизация этой гру'ппы практически не сказывается на активности, но у катепсинов В и Н и у актинидина это влияние достаточно велико. В актинидине предполагается [3167], что такой группой является карбоксильная группа остатка Glu52.
Экспериментально определяемые константы ионизации связаны с приведенными здесь микроскопическими константами соотношениями [3168]:
*12*21
к: = k.+il и к' =-----------.
*12+*21
Для многих групп в ферментах значения рК приписаны лишь на основе данных по pH-зависимости кинетических констант гидролил? веских реакций, о сложности таких отнесений уже говорилось с разд.Б.2.2.
Значения оК& карбоксильным группам Asp32 и Asp215 (соответственно 1,5 и
4,7) были приписаны на основании pH-зависимости их химической модификации эпоксидами и диазосоединениями [1343,26933, а также pH-зависимости пепсинового катализа. Реакции химической модификации - довольно сложные процессы, и нет полной уверенности в том, что эти данные однозначно характеризуют состояние ионизации исследуемых групп. Более того, учитывая удивительную симметрию расположения и взаимодействий карбоксильных групп активных центров этих ферментов (см. разд.6.5.3) можно предположить близость их рК&, а ионная асимметрия может возникать лишь в комплексе с субстратом. Хотя квантово-химический анализ [3165З в целом согласуется с этими представлениями, не исключено, что приписывание значений рэтим группам будет пересмотрено.
Данные табл.73 показывают, что потенциальные нуклеофильные группы многих ферментов или находятся в оптимуме pH действия данного фермента в очень низкой концентрации заряженной формы, как, например, сериновый гидроксил,
или же, если и полностью ионизированы, то относятся к числу весьма слабых оснований, обладающих нибкой нуклеофильностью (например, СОСГ-группа в аспартатных протеазах).
Очевидно, должны существовать механизмы, повышающие нуклеофильность (или концентрацию) данной группы или же увеличивающие реакционную способность субстрат" по отношению к сла< ому :яуклеофилу.
