Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
В свободном ферменте протонированная имидазольная группа His159 и ионизированный атом серы Cys25 лежат в одной плоскости, причем Ые2-атом Hisl59 оказывается далеко от предполагаемого места локализации N-атома уходящей группы истинных субстратов, однако имвдазольное кольцо при связывании субстрата может повернуться на <«30° и занять положение, необходимое для передачи протона. Такой поворот не сопровождается разрывом Н-связи Ne2 His159 и СО Asn175.
Связывание ингибиторов приводит и к другим перестройкам основной цепи в области Arg59-Pro68, Ser21-Gly23 и Lys156-Hls159, доходящим по амплитуде до
о
1 А. Эти конформационные изменения открывают доступ субстрата или ингибитора в область активного центра фермента. По данным исследования моделей комплекса папаина с субстратом [31233 уходящая группа субстрата в таком комплексе может неблагоприятным образом взаимодействовать с а-СН^-группой His159, однако это взаимодействие не реализуется в тетраэдрическом промежуточном соединении. Неблагоприятное взаимодействие тем сильнее, чем больше размер боковой цепи остатка Pg, что можит объяснить факт зависимости вели-чины &cat (а не Кт) от гидрофобности этого остатка в субстратах.
Исследование модели, а также данные низкого разрешения (6 А) для комплексов папаина с кваэисубстратами AlaAlaPhe(I-n)Arg и BocPhe(I-n)Arg 131243 позволяют идентифицировать участок связывания уходящей группы в районе остатков Тгр177 и А1а136 [1802]. Следует отметить, что область остатка Тгр177, по-вйдимому, соответствует той, где происходит непродуктивное связывание некоторых субстратов типа п-нитроанилидов ациламинокислот. Такой вывод был сделан на том основании, что модификация этого остатка увеличивает активность папаина к подобным субстратам [31253-
Построение модели взаимодействия цистатина с папаином [2797 3 выявило высокую комплементарность области активного центра фермента и "реактивного" центра ингибитора. Этот центр (см. также разд.5) включает остаток Gly9 ингибитора, который в комплексе должен располагаться вблизи Cys25, и консервативный участок 53-57, погружающийся в "щель" мезвду остатками Cys25 и Тгр177, гтшчем остатки ингибитора Leu54 и Val55 контакт] руют с гидрофобными участками А1а136, А1а137 и Gly23 папаина. Участок Рго103-Тгр104 ингибитора также взаимодействует с ферментом в области Тгр',77, причем оба триптофана находятся в стекинг-взаимодействии.
Папаин - пока единственная цистеиновая амидгидролаза, для которой имеются кристалографичесие данные о структуре фермент-ингибиторных соединений и комплексов. Анализ кристаллографических данных другой цистеиново? протеазы актинидина в свободном состоянии показывает значительное сходство структу-ры активного центра со структурой папаина, хотя имеются и некоторые существенные отличия [1264,12653. Так, атом серы каталитически активного остатка
о
цистеина в актинидине отдален на 2,7 А от плоскости имидазольного цикла и при такой ориентации не может образовывать Н-связь с атомом NC1 последнего. Однако, как и в папаине, имидазольное кольцо может поворачиваться на 35° так, что атом серы оказывается в одной плоскости с имидазольным хгпслом. Такое положение имидазола стабилизируется тем, что он оказывается в плоскости, параллельной плоскости индольного цикла Тгр177. Пгпаин существует в растворе в двух формах, отличающихся ориентацией шидазольного цикла по отношению к остаткам Asn175 и Asp158 (формы "вверх" и "вниз") [23433. В то же время фицин, по-видимому, существует только в одной конформации ("вверх"). Вероятно, и актинидин относится в этом отношении к типу фицина, а не папаина.
Различия в каталитических свойствах актинидина и папаина трактовались также [31263 как следствие различий в распределении электростатического поля в активном центре ферментов, однако такая трактовка встретила возражение [3127З. Заметные отличия в свойствах от папаина наблюдаются также для бро-мелаина. Изучение резонансных Раман-спектров дитиоацилферментов показало [3092], что субстрат в активном центре бромелаина имеет конформацию, отличную от таковой в папаине.
Аащжтные протеазы. Для комплекса свиного пепсина с дипептидом - метиловым эфиром фенилаланилдийодтюозина имеются рентнгеноструктурные данные
о
лишь при разрешении 3 А [3070,31283. Однако для очень сходных микробных ас-паптатных протеаз наряду с результатами относительно низкого разрешения
о
(2,8-3,7 А) [1281,1345,31293 опубликованы сведения, позволяющие достаточно подробно описать связывание субстрата в активном центре этих ферментов [2612,3071-3073,3076 3.
Активный центр аспартатных протеаз, как и в случае папаша, расположен в "щели", образуемой двумя доменами белковой молекулы. Каталитически активные группы Asp32 и Asp215 входят в состав разных доменов, но в пространст-
о
венной структуре сближены на расстояние «2,6 А (мезвду атомами кислорода). Эти группы находятся в глубине "щели".
Связывание субстратоподобных ингибиторов можно проследить на примере
