Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
ZGlyGlyPhePheOpp с *cat/Jfm=1,78-105 ГГV и
ZAlaAlaPhePheOpp с &С?И/Йт=7,05.106 М-1с~1.
Отношение этих констант соответствует изменению свободной энергии активации на 2,2 ккал/моль, что близко к вкладу гидрофобных взаимодействий (см. разд.
6.1.2) двух метальных групп, реагирующих с подцентрами S2 и S3 активного центра пепсина. Однако если в этих подцентрах (или других) происходят специфические взаимодействия (например, электростатические), то вклад вторичных взаимодействий может бнть велик и может реализоваться ситуация, когда К*>1 [30053.
в
Вклад различных взаимодействий в свободную энергию, энтаЛоШю и энтропию комплексообразования различен и зависит не только от типа взаимодействия, но и от структуры лиганда в целом, а также от энергетики сопутствующих связыванию процессов - изменения сольватации, рЖа групп белка, конформационно-го состояния и конформационных изменений фермента.
Гидрофобные взаимодействия, как правило, вносят очень малые изменения в энтальпию и контролируются главным образом энтропией ассоциации (см., например: [2470,3006]). Образование водородных связей сопровождается изменением энтальпии.
Процессы десольватации приводят к положительному изменению энтропии за счет увеличения числа трансляционных степеней свободы системы при высвобождении молекул воды. Подробно вклад различных факторов в энергию связывания ингибиторов термолизином рассмотрен в работах [2596,3007].
Дезольвахация играет важную роль при взаимодействии амидгидролаз с белковыми ингибиторами. Во многих случаях такое взаимодействие сопровождается положительным изменением энтропии [3008,30091 (см., однако: [ЗОЮ]). В случае небольших лигандов основную роль играют факторы, приводящие к отрицательному изменению энтропии (см. табл.57).
Имеется много работ, в которых энергия белок-лигандного взаимодействия рассчитывалась методами молекулярной механики или квантовой химии (см., например: [153,3011-3015]). Получаемые значения энтальпии связывания сильно зависят от метода расчета (см. также разд.6.6).
Суммарный тепловой эффект связывания лигандов зависит от pH среды и, очевидно, от ионного состояния групп белка в данных условиях. Это видно, например, из сравнения энтальпии комплексообразования с химотрипсином ряда ингибиторов при значениях pH 7,8 и 5,6 [2467,2468].
Вычленить вклад в термодинамические параметры комплексообразования кон-
формационных изменений белка - весьма сложная задача. В этой связи интересно рассмотреть данные [2469,3016,3017], в которых сравнивалась термодинамика ассоциации различных лигандов с нативными и модифицированными по группам активного центра (His57 и Ser195) химотрипсином и трипсином.
Во-первых, связывание специфических с.уСстратоподоСных ингибиторов характеризуется значительно большим отрицательным изменением энтропии, чем связывание неспецифичных ингибиторов. Во-вторых, дегидратация Ser195 или метилирование His57 приводит к существенному положительному изменению энтропии ассоциации, что, по-видимому, объясняется большей подвижностью лигандов в комплексах с модифицированными белками и отсутствием в таких белках индуцированных лигандами конформационных изменений [2469]. Отмечено также [3018], что связывание лигандов с мономерной формой химотрипсина значительно более эффективно, чем с димером.
Таким образом, изменения свободной энергии, энтальпии и энтропии ассоциации зависят от очень многих факторов, которые не всегда поддаются учету.
Ниже (см. разд.6.6) мы попытаемся оценить полную энергию связывания фермента и субстрата на основании данных о взаимодействиях, реализующихся в комплексе, которые получены с помощью рентгеноструктурного анализа.
6.4. Конформационные изменения
Связывание субстратов и ингибиторов ферментами часто приводит к конформаци-онным изменениям белковых молекул, которые можно регистрировать спектральными методами (изменения в УФ-спектрах, спектрах флуоресценции, кругового дихроизма и т.п.), термохимическими методами (по изломам на графинах Аррениуса) и методами рентгеноструктурного анализа. Эти изменения могут быть очень небольшими и затрагивать лишь локальные участки молекулы белка, особенно ориентацию боковых цепей его аминокислотных остатков (см., например: [1375,1378,3019-3022]), а могут также быть связаны с изменениями азаимной ориентации доменов в белках [30231.
Динамическая подвижность белков - свойство белковой молекулы, не зависящее от наличия лиганда. Изменение конформации, индуцируемое лигандом, по-видимому, происходит в рамках тех состояний, которые разрешены и для свободной белковой молекулы. Например, расчеты методом атом-атомных потенциалов [3024] показывают, что боковая цепь остатка Sen95 в а-химотрипсине фиксируется в положении с Х-^900 за счет водородной связи с молекулой воды. При связывании субстрата и вытеснении воды боковая цепь этого остатка приобретает практически полную свободу вращения вокруг связи Са~С в пределах х1 от -120 до +120°
(рис.93). Глобальный минимум энергии этого остатка (при ^=90°) лишь на 2-3 ккал/молс
