Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Наконец, следует отметить аллостерическое действие Clq-фактора системы комплемента на активацию С1S-C1г-факторов [29271 и сходное действие стреп-токиназы на активацию плазминогена [29281.
5.12. Автолиз
Автолитическое расщепление ферментов - свойство, присущее только протеазам. Оно заключается в катализе протеазой гидролиза амидных связей в молекулах того же фермента, подвергшегося частичной или полной денатурации. В простейшем случае кинетика инактивации фермента за счет автолиза описывается схемо!::
Ew -------- Ер; Ер + Ew ---------• продукты,
где ED - денатурированная форма фермента, а соответствующее кинетическое выражение для скорости инактивации будет [24781:
d[E]w
— = W[V>2-
Можно показать, что начальная скорость денатурации л [Е1
1 о
V = 11m --1П
t-*o t [Е1J
где [ЕК - концентрация Е„ в момент времени t. Из зависимости --In ------------- от
t * t tE3t
t, экстраполируя к t=О, можно получить значение йо=й{Яс - значение эффективной константы скорости денатурации. Для а-химотрипсина эти величины оказались равными 9 М-1с-1 при температуре 40°С и 100 М-1с~1 при температуре 49,5°С (pH 7,6) [2478]. Как видно из уравнения для скорости инактивации, последняя зависит от квадрата начальной концентрации фермента, поэтому скорость автолиза очень быстро увеличивается с увеличением концентрации растворов протеаз. Заметный автолиз трипсина происходит даже при хранении лио-филизованного фермента [2921. Автолиз особенно эффективно происходит в оптимуме pH действия фермента, однако отмечены случаи автокаталитической инактивации и при значениях pH, сильно отличающихся от оптимальных 129291. Даже при очистке трипсина на сульфоэтилсефадексе при pH 2,6 наблюдается заметный автолиз [29301. Автолиз пепсина весьма заметно происходит при его 1фисталлизации [2931] ив растворе при различных воздействиях (рис.89) [2932]. Скорость автолиза отличается у ферментов разных групп. Так, экзопептидазы (карбоксипептидаза А и др.) довольно устойчивы в отношении само-переваривания [1213]- Более того, разные изоферменты химозина заметно различаются по скорости автолиза [2933,2934].
РИС.89. pH-Зависимость активности (4) и концентрации (С) растворимых в три-хлоруксусной кислоте продуктов автолиза пепсина [2932]
1- в водном растворе;
2- в 8 М мочевине;
3- в 4 М гуанидинхлориде
Автолиз может ускоряться различными соединениями. Так, дитиотриэтол и дитиоэритритол стимулируют автолиз папаина, тогда как меркаптоэтанол на этот процесс влияния не оказывает [29341- Автолиз химотрипсина промотирует-ся 1фасителем голубым Эванса [29351.
Ранее считалось, что автолиз может приводить к фрагментам протеаз, сохраняющим каталитическую активность (см., например: [2936]). Действительно, многие случаи автокаталитического расщепления ведут к активным формам (например, превращение 6-химотрипсина в а-химотрипсин). Однако глубокий автолиз неизбежно ведет к инактивации фермента.
5.13. Заключение
Каталитическая активность амидгидролаз изменяется под действием самых разных факторов. Два из них наиболее существенны: изменение зарядов ионизирующихся групп фермента, особенно групп активного центра, и конформационные перестройки белковой глобулы. Уже при активации зимогенов образование ката-
литически активного белка связано в первую очередь с изменением конформации, приводящим к формированию связывающего субстрат участка активного центра. Изменение pH, температуры, ионной силы раствора также приводят к локальным или Солее общим конформационным перестройкам молекулы фермента. Таким образом, конформационная лабильность является, по-видимому, непременным условием активности и регуляции амидгидролаз.
Существование большого числа весьма спещйжч еских ингибиторов позволяет не только изменять активность амидгидролаз, но и исследовать структуру активных центров, в том числе и взаимное расположение функционально важных групп. Это особенно ценно при кристаллографическом изучении ферментов.
ФЕРМЕНТ-СГЗСТРАТНЫь КОМПЛЕКСЫ
В предыдущих главах мы познакомились со структурой и свойстиа.ли участников процесса ферментативного гидролиза амидной оьяди . „а также с важнейшими экспериментальными фактами, касающимися самого процесса. В этой и следующей главе мы проследим детально за всеми собъ,тиями, происходящими в ходе катализа, анализируя их с точки зрения структуры взаимодействующих веществ. К сожалению, в настоящее время это можно сделать лишь на ограниченном числе примеров, для которых, главным образом благ„даря успехам кристаллографии белков, имеется достаточно детальная'картина происходящих событий.
В основе всех представлений современной эньимологии лежит идея об образовании фермент-субстратного комплекса. Эта -идея проверена и получила подтверждение многими прямыми и косвенными методами, гажньЛшие из которых были уже рассмотрены выше и будут рассмотрены в ходе дальнейшего изложения.
6.1. Силы взаимодействия
6.1.1. Дисперсионные взаимодействия
