Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
В качестве аналогов переходного состояния рассматриваются также природные ингибиторы амидгидролаз - фосфоамидон и пепстатин (см. разд. 5.9.6) [28911. Рентгеноструктурные данные [2892,28931 показывают, что фосфорная группа своим атомом кислорода образует координационную связь с атомом цинка в термолизине, одгико более близким к переходному состоянию является комплекс термолизина с (H0)?P(0 )NHLeuNH2. В этом случае оба тсисюродных атома ингибитора связаны с Zn, т.е. последний становится пентакоординированным [28931.
В комплексе пепсина с пепстатином роль тетраэдрического атома углерода играет р-углерод остатка статина [27251 (подробнее см. гл.6.). Комплексооб-разование пепстатина с пепсином происходит ступенчато [28941.
Являются ли ингибиторы - "аналоги переходных состояний" - действительно аналогами переходного состояния субстрата в реакциях гидролиза? По моему мнению, этот термин весьма сомнителен.
Связывание борной кеслоты, например с химотрипсином, и связывание ее с модельным соединением - амидом саливд^оьэй кислоты примерно одинаково
(лСо= -1,4 и -2,1 ккал/моль соответственно [2848]), так что Сорная кислота даже эффективнее связывается в модельном опыте. В то же ?ремя свободная энергия переноса фенилэтильной группы из воды в октанол (-4,2 ккал/моль [19711) равна свободной энергии переноса этой группы из воды в полость активного центра фермента. Таким образом, суммарное изменение свободной энергии при связывании фенилэтилборной кислоты ферментом (-5,6 ккал/моль) не выше, а даже ниже, чем свободная энергия связывания этого соединения с мо ¦ дельным веществом и энергия переноса в неполярное окружение (-6,3 ккал на моль). Повышенное сродство этих "аналогов переходного состояния" определяется просто дополнительными по сравнению, например, с эфиром гидрокоричной кислоты (дСо=3,7 ккал/моль [2468]) взаимодействиями в активном центре фермента. То же самое можно сказать об альдегидах, образующих ковалентную связь с каталитически активной группой фермента. Что касается пепстатина, то связывание его с пепсином (дСо=-12,4 ккал/моль) ухудшается при удалении гидроксильных групп (имитирующих, как предполагается [2725,2895], структуру переходного состояния), но приводит к снижению свободной энергии всего на 3,2 ккал/моль [2724]. Это вполне может быть отнесено к образованию гидроксилом слабых (или слабой) водородных связей с ферментом. В лучшем случае этот тип ингибиторов можно было бы назвать аналогами промежуточного тетраэдрического соединения.
Алкилборные кислоты оказались полезным инструментом для анализа топографии активных центров сериновых протеаз [2847,2862,2863]. Исследование зависимости К{ от длины углеводородной цепи позволяет составить представление о расстояниях между каталитическим и сорбционным центрами и о протяженности последнего (рис.88).
а б
РИС.88. Зависимость констант ассоциации алкилборных кислот от длины алкильной цепи (и гйдрофобности) (а) и схематическое представление топографии активных центров амидгидролаз (б)
7— пенициллинамидаза; 2- мезентерикопептидаза; з- субтилизин;
4- химотрипсин; 1- B(OH)g; II- алкильная цепь; III— каталитические группы
фермента; ту- гидрофобный участок
5.10. Активация
Ряд органических соединений активирует ферментативный гидролиз. К числу таких активаторов относятся суСстратоподоСные соединения и соединения, имитирующие отдельные фрагменты субстрата. Для некоторых ферментов отмечается способность активироваться избытком субстрата (см. разд.5.9.3). Кроме того, хорошо известна активирующая роль ионов металлов. В этом отношении интересным примером является плазменный белок С, активность которого линейно зависит от квадрата концентрации ионов Na+ [2896,28971.
Кинетическая активация описывается тем же обобщенным уравнением (25) (см. разд.5.9.1), что и действие ингибиторов при значениях р>1 и а<1.¦При а>1 в зависимости от соотношения аи|3 будет наблюдаться ингибирование или активация.
Типичным примером активации субстратом является катализ карбоксипептида-зой А, где комплекс ES2 превращается в продукты реакции в 2-5 раз быстрее, чем комплекс ES [1738]. Активация субстратом была также отмечена при катализе эластазой из лейкоцитов [2898] и некоторыми другими ферментами.
Катализ карбоксипептидазой А ускоряется также при введении ряда пептидов, не гидролизующихся зтим ферментом [28991- Такие пептиды обладают большим сродством к ферменту, чем субстраты, а комплекс ЕА (где А - активатор) лучше связывает субстрат, чем свободный фермент.
Сходным образом ведут себя аспартатные протеазы - пепсин и пепщиллопеп-син [2900-2904]. В случае пенициллопепсина гидролиз LeuTyrNH2 ускоряется негидролизуемым пептидом LeuGlyLeu, причем увеличивается *cat (р»10), а Г
остается неизменной. Сродство фермента к активатору Кд=2-10~3 М [2900].
Детальное исследование активации пепсина [2901-2904] показало, что в зависимости от структуры субстрата и активатора активация может проходить по неконкурентному (а=1, р>1) и смешанному (а и р>1) типам. Значения р в отдельных случаях достигают 70. Обязательным условием активации оказалось наличие у субстрата и активатора, по крайней мере, по одной незащищенной концевой амино- или карбоксигруппы. Было установлено [2902], что при катализируемом пепсином гидролизе дипептида HPhe(N0?)PheApm в присутствии трипепти-да ZPheAlaAlaOH активация происходит по механизму синтеза-гидролиза:
