Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Су кцини лхимо трипсин Asp (COO-) >sp (CONHCHgCHgNH* ) 8.0
Этилендиаминхимотрипсин Glu(C00“) Glu(C0KHCH2CH2MH+) 6,1
Эффекты поверхностного заряда особенно сильно проявляются при низких ионных силах раствора. Следует отметить, что сукцинилирование практически не изменяет конформацию химотрипсина [2301].
Условие активности -олько одной формы фермента обычно выполняется, хотя известны случаи наличия на кривых pH-зависимости двух или более максимумов,
которые можно интерпретировать как результат активности нескольких ионных форм. Это явление, однако, может быть связано также или с наличием в препарате примесей другого фермента, активного при ином значении pH, или с процессами активации анионом (например, хлора) и т.п.
Условие быстрого установления прототропного равновесия, как правило, выполняется. Наиболее сложный и интересный вопрос заключается в постоянстве лимитирующей скорость стадии.
Уже для простейшей схемы
Е + S «-------- ES ------> Е + Р,
й-1
1»&2), а кинетике
подчиняющейся не кинетике Михаэлиса (ft (й_ ««ftg), могут возникать сложности, обусловленные й и й2 при
Бриггса-Холдейна изменением соотношения изменении pH. Так, оказалось [2297,2298,2300,23021, что рйа свободного химотрипсина для быстро гидролизуемого субстрата п-нитрофенило-вого эфщэа ацетил-1-триптофана на 0,3 единицы меньше, чем рКа по гидролизу этилового эфщэа или амида ацетил-Ь-фенилаланина (рК& свободного фермента, по определению, не должно зависеть от типа субстрата) (рис.74).
Это o6jсловлено тем, что при высоких pH для n-нитрофенилового эфира соблюдается условие йэ>й_,, а при по-
рКц(фермент)
-------
Кинетический / рКр __ . /
нижении pH т.е. при низких - ft
условие й2>й й2 становится
1 ’
меньше ft
высоких pH й ./К =й., а при
r cat ml ±
. +/к =й„/к .
cat m2 в
^cat/^m ~ (^г/*s) * Каарермент)/[Н*]
РИС.74. График, поясняющий различие мевду истинным и "кинетическим" рК в
3
механизме Бриггса-Холдейна, обусловленное изменением лимитирующей стадии с изменением pH [2298]
pH
Наблюдаемое кинетическое значение константы ионизации в этом случае рав-
но:
Vй-1
(14)
где Ка - истинная константа ионизации группы фермента. В случае трехстадийной схемы:
Е + S
ES
ер2
+
Р,
Е + Р„
изменение pH может приводить к смене лимитирующей скорость стадии. При этом, если обе стадии контролируются группами с разными значениями рК& (или
рК& груш меняется при переходе от одной стадии к другой) зависимость ftcat и Кт от pH могут иметь довольно сложный характер, однако смена лимитирующей скорость стадии не должна сказываться на виде зависимости k JK от pH.
cat ш
Если на пути от субстрата к продукту образуется не один, а несколько фермент-субстратных комплексов, например:
й1 &2 й3
Е + S --------» ES -------* E*S ---------* Е + Р,
й-1 й-г
то кинетический параметр
ftcat
к
т
где Кр =
(15)
fe_2+fe3
Очевидно, что и здесь измеряемое в опыте значение рйа свободного фермента может зависеть от типа субстрата в том случае, если изменение pH по разному влияет на йр для разных фермент-субстратных комплексов.
Значения рйа, получаемые из pH-зависимости ве.тшч'-ш и Кт, могут отличаться от истинных значений рйа ионизации групп фермент-субстратного комплекса, если значительная часть субстрата связывается непродуктивно. В этом случае наблюдаемое значение рКа (р^а) будет [20001:
1+й
рк; = рка - <16>
где Кий'- константы равновесия между продуктивными (HES и ES) и непродуктивными (HES’ и ES') комплексами. Значение рйа свободного фермента (из зависимости &са1/йт от pH) не будет изменяться при наличии непродуктивного связывания.
Многие амидгидролазы неустойчивы при крайних значениях pH, подвергаясь обратимым или необратимым конформационным изменениям. В общем виде зависимость каталитических констант от pH в случае перехода одной формы фермента в другую рассмотрена в работе [23031. Протеолитические ферменты, кроме того, могут подвергаться автолизу (см. разд.5.11). Например, большинство аспартатных протеаз устойчиво лишь в кислой или слабокислой среде и необратимо инактивируются при рН>6. Сериновые протеазы обратимо инактивируются в сильнокислой среде [13751. Весьма подробно была исследована обратимая инактивация химотрипсина при высоких значениях pH [2304-23081. Оказалось, что уже при pH 6-8 раствор этого фермента содержит около 10% неактивной формы, теряющей способность связывать субстрат (рис.75). Конформаштольый переход активной формы химотрипсина в неактивную обусловлен разрывом солевой связи Ile16-Asp194, причем в неактивной форме аминогруппа 11е16 имеет нормальное значение рйа (7,8), а в активной - существенно более высокое (»1О). Субстраты и субстратоподобные ингибиторы смещают равновесие в сторону активной формы.
