Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
где f = 1 + [Н+]/й +iL/[H+] и /' = 1 + [Н+]/й'+й./Ш+] ~ так называемые рН-
а. о а о
функции Михаэли с a [1661, с.138].
Таким образом, получаемые в эксперименте кинетические константы будут
связаны с концентрацией водородных ионов следующими соотношениями:
где &cat и Кт - относятся к предельным, независимым от pH значениям констант. Из этих уравнений ясно, что в простейшем случае зависимости &cat и Кт от pH уравнения (3) и (4) отражают ионизацию групп в фермент-субстратном комплексе, а соответствующая зависимость kcat/Km - ионизацию групп свободного фермента.
Очевидно, что в области высоких концентраций ионов водорода членами, включающими Кь и К^ в уравнениях (3)-(5), можно пренебречь. Логарифмируя полученные при этом условии выражения, для * t, К и йоа1/йт имеем;
ЕН2 --------- eh2s
М *.1
cat
ЕН *—EHS
ЕН + Р.
(1)
М 1ч
Е ----------------- ES
V
(2)
cat
cat
(3)
1 + [Н+]/Я' + Й'/[Н+]
а Ь
К (1 + [Н+]/Х + JL/[H+]) т' а Ь
(4)
1 + ш+]/к’ + z:/iH+]
а Ь
к УК = (к УК )
cat т cat ш
1 + [H+]/if + KV[H+]
а Ъ
(5)
(6)
igKm- = igKm+ig(1+[Н+]/ка-lg(1+[Н+]/я;)
(7)
(8)
Как видно, при [Н+]«йа (и К^) соответствующие константы не зависят от pH, а при [Н+]»йа (и К
Что касается значений Кт, то при оно не зависит от pH. Если же соблю-
дается условие К «Ш+]«К' или К «[Н+]«Х , то уравнение (7) редуцируется до
а а а а
выражений, аналогичных (9) и (10).
Предложены также и другие приемы опрьделения этих величин [2297,22981 В более сложных случаях, например при четырех ионных состояниях фермента Е, ЕН, ЕН2 и ЕН3 pH-функция Михаэлиса имеет вид:
где Кс, Кь и Ка - константы ионизации форм ЕН, ЕН2 и ЕН3 соответственно. Зависимость lgkcat от pH в этом случае будет представлять собой ряд отрезков с наклонами +2, +1, 0 и -1.
Субстратами многих амидгидролаз являются соединения, несущие ионогенные группы. Учет ионизации субстрата приводит к довольно сложным зависимостям кинетических констант от pH. Для простейшего случая, когда фермент связывает только одну форму субстрата, а константа диссоциации свободного фермента и фермент-субстратного комплекса одинаковы:
(9)
cat
cat
ig-
к
= ig-
- рйа*рн.
(10)
m
К
m
Таким образом, строя зависимости логарифмов кинетических констант от pH, можно определить значения рКа и piT (рис. 73). Аналогично определяются значения р^ и рй^ [2295,2296].
рпа=8,76 *>ис.73. pH-Зависимости кинетических
констант гидролиза этилового эфира Ы-ацетил-Ь-тирозина а-химотрипсином
(25°С; Ц=0,1)
5 6 7 8 9 ЮрН
(11 )
ЕНг + s
M
EH + S
M
E + S
eh2s
к
EHS
Iя;
' cat
ЕР + P,
(12)
скорость реакции выразится так: * + cat
— s + н+,
v
----[Е] [S]
1 + [Н+]/К + JL/[H+] ° °
а Ь
К (1 + К [Н+]) + [S]
(13)
5.2.2. Интерпретация значений констант ионизации
При выводе уравнений, связывающих кинетические параметры с pH, делается ряд допущений, а именно: 1) группы ведут себя как идеально титрующиеся кислоты и основания, причем изменение состояния ионизации других ионогенных групп, не участвующих в связывании и превращении субстрата, не влияет на ионизацию рассматриваемых групп 2) активна только одна форма фермента; 3) процессы переноса протонов осуществляются быстрее химических процессов; 4) лимитирующая скорость всего процесса стьдия остается одной и той же при всех значениях pH; 5) фермент устойчив при всех значениях pH [2299].
Рассмотрим подробнее выполнимость этих условий. Белок содержит большое число ионогенных групп, расположенных обычно на его поверхности. Состояние ионизации этих групп может влиять на рйа групп, участвующих в связывании субстрата и в катализе [2300]. йгже приведены значения рКа каталитически активных групп химотрипсина и его производных, имеющих различный поверхностный заряд [1613, с.177]:
Фермент Тип модификации
Химотрипсин E-Lys (ИН3 )->E-Lys (КНС0СН2СН2С0СГ) 7.0
