Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Анджапаридзе О.Г. -> "Культура ткани в вирусологических исследованиях" -> 91

Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.

Анджапаридзе О.Г. Культура ткани в вирусологических исследованиях — Москва, 1962. — 207 c.
Скачать (прямая ссылка): kulturarkani1962.djvu
Предыдущая << 1 .. 85 86 87 88 89 90 < 91 > 92 93 94 95 96 97 .. 101 >> Следующая

О'гобранную бляшку (точнее слой агара над этой бляшкой) удаляют с помощью пастеровской пипетки. Извлеченный агаровый цилиндр суспендируют в 1 мл раствора Эрла, среде с лак-тальбумином или 199. Затем эту суспензию несколько раз замораживают и оттаивают, после чего ею заражают однослойные культуры клеток или используют для получения второй генерации бляшек. Вирус_ считается достаточно очищенным, если он прошел не менее трех пассажей по указанной методике.
Большое значение для разработки методов получения чистых « -------- мябпюпения Александера, Коха, Маунтей'
I на, Дамма (1958). Они установили, что РНК, экстрагированная из вирусов полиомиелита I, и II типа, Коксаки В-5, А-7, ECHO ' типов I и 10, вызывает образование бляшек в однослойных куль-пурах перевиваемых клеток амниона человека или HeLa. Из этих колоний были выделены виру-сы, которые по своим свойствам идентичны исходному. Перспективность использования РНК,1ЩИ селекции вирусов методом бляшек совершенно очевидна.
Приведенные факты о влиянии состава агарового покрытия на образование бляшек послужили основой для разработки ме-тодов селекции вирусов с определенными свойствами.
Такемори, Номура и др. (Takemori, Nomura ct al., 1958) описали простую методику выделения линий вируса полиомиелита, устойчивых к действию ингибиторов нормальной бычьей сыворотки, так называемых i-мутантов. Однослойные культуры клеток HeLa заражают вирусом полиомиелита I типа в разведении 10-4—10~5. Затем в одну половину флаконов вносят покрытие с 10% сыворотки без ингибиторов, в другую — идентичную смесь 2,2% агара (4 мл), питательной среды в двойной концентрации (3,2 мл раствора Эрла с 0,1% дрожжевого экстракта и 0,5% гидролизата лактальбумина) и сыворотки с ингибиторами вируса (0,8 мл). В контрольных флаконах отмечают появление больших колоний вируса диаметром до 8—10 мм. Под покрытием с ингибиторами образуются в основном мелкие (не больше 0,5—1 мм) бляшки. Однако среди этих бляшек обнаруживают более крупные — размером 2—2,5 мм. При выделении из указанных колоний вируса и повторном его испытании на резистентность к ингибиторам сывортки было установлено, что i-признак является наследственно закрепленным.
\ Большое значение для селекции вирусов с измененной пато-: генностью имеет существование известной корреляции между вирулентностью и рядом выявляемых in vitro признаков или^как . их иногда называют, маркеров.. К таким признакам относятся ; размеры бляшек, способность вирусов вызывать появление бля-‘ щек в определенных клетках, под агаром с разными концентрациями соды и т. д.
Макклейн, Хаккет, Мейдин (1958) изучали колонии 7 штам-¦. мов везикулярного стоматита свиней (А«, D53, Е54, G55, В51, С52,
I, F55). Все штаммы, за исключением G55, в однослойных культу-
1 рах перевиваемых клеток почек свиней вызывали появление двух ¦ типов бляшек: крупных, диаметром 2—10 мм, и мелких, не боль-i ше 0,5—1 мм. При заражении свиней смешанной популяцией ! или чистой линией, полученной из крупных бляшек, наблюдали развитие типичной клинической картины везикулярной энантемы. Очищенная линия из мелких бляшек вызывала лишь атипичное заболевание.
Следует отметить, что размеры бляшек, по-видимому, не могут служить достаточно надежным критерием для дифференцирования вирулентных и авирулентных штаммов. Достаточно на-
помнить приводившиеся ранее примеры о различиях в диаметре бляшек у штаммов вирусов полиомиелита, обладавших примерно одинаковой патогенностью для обезьян.
Фогт, Делбекко и Веннер (1957) изучали образование бляшек вирусами полиомиелита всех трех типов под агаровым покрытием с разным значением pH. Для создания щелочного pH NaHC03 добавляют из расчета 2,752 г/л; агаровое покрытие с кислым pH получают при внесении NaHC03 в концентрации 0,55 г/л, нейтральную реакцию устанавливают с помощью бикарбоната натрия, взятого в концентрации 0,73 г/'л. Опыты проводили с клетками почек обезьян, выращенными в чашках Петри. После заражения и нанесения покрытия культуры помещали в термостат с подачей С02 в таких количествах, которые необходимы для поддержания pH 6, 8; 6,9 и 7,5 во флаконах с кислым, нейтральным и щелочным покрытием соответственно.
Было установлено, что патогенные штаммы вирусов полиомиелита при разных значениях pH вызывают появление одинакового количества бляшек, причем сроки образования бляшек в обоих случаях совпадают. Авирулеитные штаммы под агаром с кислым pH образовали немногочисленные колонии, число которых было в 100 ООО и 1 ООО ООО раз меньше, чем при опытах с щелочным или нейтральным покрытием для штаммов I, III или П типа соответственно. Кроме того, авирулентные штаммы при pH 6,8 вызывали появление бляшек в более поздние сроки, чем при pH 7,5 или 6,9 (для II типа). Их обозначают d-мутантами ^от английского слова delayed, что означает замедленный).
Фогт, Делбекко и Веннер (1957) на основании исследования 15 штаммов нашли, что отношение числа бляшек, образовавшихся под кислым агаровым покрытием, к числу бляшек под щелочным покрытием представляет величину одного порядка для ави-рулентных и другую для вирулентных линий. Это отношение для штаммов, непатогенных для обезьян, равнялось 10~1 или 5-10“Иными словами, для получения бляшек d-штамма при кислом pH культуры следует заражать цельным инфекционным материалом или в разведении 10~
Предыдущая << 1 .. 85 86 87 88 89 90 < 91 > 92 93 94 95 96 97 .. 101 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed