Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Анджапаридзе О.Г. -> "Культура ткани в вирусологических исследованиях" -> 87

Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.

Анджапаридзе О.Г. Культура ткани в вирусологических исследованиях — Москва, 1962. — 207 c.
Скачать (прямая ссылка): kulturarkani1962.djvu
Предыдущая << 1 .. 81 82 83 84 85 86 < 87 > 88 89 90 91 92 93 .. 101 >> Следующая

Недостатком метода, как указывает сам автор, является необходимость использовать очень большие концентрации клеток, значительно превышающие количества при исследовании колоний вируса в однослойных культурах. Так, при опытах с вирусом везикулярного стоматита в одну чашку вносят около 10 млн. клеток куриных фибробластов.
Влияние различных факторов на образование бляшек в суспензиях клеток было изучено Уотерсоном (1958). Он находит, что количество отдельных колоний вируса чумы птиц зависит от концентрации клеток куриных фибробластов, от состава питательной среды и от свойств используемой серии нейтрального красного. Снижение концентрации клеток в агаре с 220—97,5* Ю6 до 50—32*10® ведет к уменьшению числа бляшек и резко затрудняет их подсчет. При введении в состав агарового покрытия 0,5% гидролизата лактальбумина, 0,1% дрожжевого экстракта и
0,1% бычьего альбумина вместо раствора Гея и куриного эмбрионального экстракта отмечали снижение титра, выраженного числом бляшкообразующих доз, примерно в 2 раза. При использовании различных серий нейтрального красного наблюдали выраженную в неодинаковой степени токсичность последнего. В результате токсического действия препарата происходило уменьшение числа бляшек, в некоторых случаях полностью подавлялось их образование.
Метод Купера был исиользован Львовым и Львовой (Lwoff А., Lwoff М., 1960) для получения отдельных колоний вирусов полиомиелита в суспензии клеток КВ. Опыты проводят с так называемым диким штаммом клеток и с клональной линией этих клеток (КВ-1). Соответствущее разведение вируса в объеме
0,1 мл смешивают с 0,2 мл клеточной суспензии (около 4 млн. клеток). Все дальнейшие операции проводят по ранее описанной методике Купера. Культуры инкубируют при разных температурах (от 35 до 4Г) в течение 72 часов. Авторы указывают, что отдельные колонии вируса легко различались в неокрашенных культурах. Однако для облегчения подсчета бляшек они рекомендуют использовать раствор трипановой синьки. 1% маточный раствор готовят на дистиллированной воде. Перед употреблением этот раствор разводят в 2 раза средой с 0,5% гидро-лизата лактальбумина в растворе Хэнкса или на фосфатнобу-ферном физиологическом растворе, приготовленном по прописи Делбекко и Фогт (1954). 2 мл раствора осторожно вносят пинеткой в чашку Петри и оставляют в течение 20—30 минут либо при комнатной температуре, либо при 36°, а затем краску удаляют. Бляшки подсчитывают немедленно или через несколько часов, а в отдельных случаях на другой день, но при этом чашки должны находиться в термостате.
В отличие от общепринятого метода, при котором краску (нейтральный красный) поглощают живые клетки, благодаря че-¦UV кппл«ни "RHDvca выделяются на красном фоне в виде бес-
цветных участков, трипановая синька адсорбируется только мертвыми клетками, поэтому бляшки приобретают темно-синий цвет.
Авторы подчеркивают, что успех опыта зависит в значительной степени от качества применяемой трипановой синьки. Одни серии дают хорошие результаты при кислом pH среды (около 6,5), другие — при слабо щелочном (7,2).
Изолированные колонии вируса в однослойных культурах или в суспензиях клеток, взвешенных в агаре, представляют видимые макроскопически неокрашенные округлой формы участки, четко выделяющиеся на фоне живых клеток, окрашенных в красный цвет.
При учете бляшек следует обращать внимание не только на их число, но так же и на их размеры, срок появления и характер краев.
При использовании метода бляшек титр вируса, как правило, выражается числом бляшкообразующих доз в I мл. При этом для подсчета используют простую формулу:
А- —
о’ (1)
где: А — число бляшкообразных доз в 1 мл, а — среднее число бляшек на одну чашку, b — разведение вируса,
v — объем вируссодержащего материала, внесенного в чашку.
Таблица 25
Титрование методом бляшек вируса полиомиелита типа 1 (штамм 54—1342) в культуре почечного эпителия обезьян
Разведение Число бляшек Среднее Число бляшко-
I1 2 3

320
10-3 90 120 110 --- = 107 5,4-10°
3
10- 4 16 22 18 “ , 19 8,5- 10s
3
ю
10" ° о 3 5 --- =3 15 10:)
3
1 Номер матраса.
Пример. При заражении однослойных культур почек обезьян вирусом полиомиелита типа I в разведении 10~3, 10~4, 10~5 среднее количество отдельных колоний в матрасе емкостью 100 мл составляло 107, 19 и 3 соответственно (табл. 25). Каждое раз-ведение вируса в объеме 0,2 мл вносили в 3 матраса. Найденное среднее число бляшек на матрас (для данного разведения) подставляем в формулу 1 и получаем:
0,2
Предыдущая << 1 .. 81 82 83 84 85 86 < 87 > 88 89 90 91 92 93 .. 101 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed