Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Вессельброн, которые хорошо рТзвдож*’ ЭНЦефадита S,
ных фибробластов, „0 нПЦвГГпГСЯ Б «УРИ-
!?И.МЫ* п°ражений клеток, лали МоРФологически
перечисленные вирусы вычн^ положительные результаты Все
ных культурах фйро6л ““в "И°™ГГ
тодики. Ри использовании следующей ме-
Куриные фибробласты выращивают в 5/о телячьей сыворотки 0 5% гилппт^ Р ле> содержавшей
cpaiVPrkhaiorTp""Tapi“ssferSJ
А—„ос/ьа^
став покрытия входит одна часть 2% агара в дистиллированной
Т>яедИ ППТаТеЛЬНЫЙ раствоР- Последний содержит 20% раствора А (Ю-кратная концентрация), 10% раствора Гея В, 10% органического буфера трис 0,2 М, pH 7,6; 10% гидролизата лак-тальоумина (5 г на 100 мл) с 10% телячьей сыворотки, нейтрального красного (1 : 1000) и 30% дистиллированной воды.
При использовании этого покрытия клетки переживали в течение 6—7 дней при 37° в термостате с высокой влажностью воздуха, но без добавления С02.
Таким образом, при методах получения колоний вируса используют ряд общих ингредиентов: агар, сыворотки, нейтральный красный и солевые растворы {Хэнкса или Эрла). Остановимся на некоторых особенностях применения этих ингредиентов и на выборе вида ткани для опыта. Делбекко, а в последующем и другие авторы указывали как на одно из обязательных условий получения бляшек использование вирусов, которые обладают ци-топатогенным действием. Однако Портерфилд (1959), Гендер-сон и Тейлор (1959) показали, что значительное число трансмиссивных вирусов, размножение которых в культуре ткани не сопровождается или сопровождается незначительным цитопато-генным эффектом, может вызывать образование бляшек.
Интересным примером получения колоний вируса со слабо выраженными цитопатогенными свойствами являются исследования Бенсона и Хотчина (Benson, Hotchin, 1960). Как известно, вирус лимфоцитарного хориоменингита хорошо размножается в клеточных культурах разного типа, но не вызывает при этом цитопатогенных изменений. Такие данные были получены при использовании ряда штаммов перевиваемых клеток: HeLa, Детройт-6, клеток кишечника, печени и почек человека, штамма^ FL и L, а также первичных культур клеток амниона человека. Бенсон и Хотчин (1960) показали, что при длительном (до 3 недель и более) инкубировании культур фибробластов куриного эмбриона, зараженных вирусов лимфоцитарного хориоменингита, развивается цитопатогенный эффект, который вначале проявляется в более медленном по сравнению с контрольными пробирками - — -. мртяйппншя и появлении зер-
нистости клеток. В последующие дни наблюдалась деструкция большинства клеток зараженных культур.
После 40 пассажей вируса лимфоцитарного хориоменингита на культурах куриных фибробластов срок развития цитопатоген-иого действия значительно сократился.
Эти наблюдения побудили авторов использовать культуры данного типа для титрования вируса лимфоцитарного хориоменингита по методу бляшек. В чашки Петри диаметром 10 см вносят 10 мл клеточной взвеси, содержащей 1,2—1,5X10® клеток и 1 мл. После формирования монослоя в каждую чашку вносили 0,5 мл соответствующего разведения вируса. Период адсорбции составлял AU часа. Затем в чашки наливали по 4 мл покрытия, состоящего из 15% триптозофосфатного бульона, 1% агара и 84% среды 199. На 2-, 6- и 10-й день в чашки вносили дополнительно по 3 мл покрытия, причем в последний раз питательная смесь содержала нейтральный красный в концентрации 1 :8000.
На 12-й день после инокуляции на чашках появлялись круглые колонии диаметром около 5 мм. При раздельной проверке инфекциозности (внутримозговое введение мышам) суспензий, приготовленных из участков культуры, соответствующих местоположению бляшек, и из участков, находящихся вне колоний, заболевание и гибель мышей с типичной для лимфоцитарного хориоменингита клинической картиной наблюдались лишь в первом случае.
Таким образом, выявление отдельных колоний вируса, по-ви-димому, возможно в любых культурах, представляющих благоприятную среду для накопления данного агента. Так, бляшки вируса полиомиелита были получены в однослойных культурах клеток почек обезьян, амниона человека, HeLa, Нер-2, СОЦ, тес-тикулах обезьяны, фибробластах человека (Н. Н. Гинсбург, К. Т, Касымов, 1959, Л. Г. Степанова, 1959; Делбекко, Фогт, 1954; Фох, Лунд, 1955; Янгнер, 1956). Четкие результаты наблюдали при экспериментах с вирусом простого герпеса в культурах клеток почечного эпителия кроликов, обезьян и в клетках амниона человека (Янгнер, 1956; Каплан, 1957); вирус осповак-цины вызывал появление бляшек в однослойных культурах куриных фибробластов и почечного эпителия обезьян [Янгнер, 1956; Нойес, 1953; Фогт, Делбекко, Веннер (Wenner, 1957)]. Описано образование бляшек вирусом везикулярного стоматита в клетках куриных фибробластов (Макклейн, Хаккет, 1958). При выборе ткани, необходимой для изучения отдельных колоний вируса, экспериментатор должен использовать любую имеющуюся в лаборатории ткань, чувствительную к изучаемому агенту. Следует отметить одно важное обстоятельство. Для постановки опыта необходимо брать лишь те флаконы и чашки, в которых сформировался сплошной монослой нормальных клеток. Недостаточное развитие монослоя может, во-первых, уменьшить созможность распространения вируса от клетки к клетке и тем
