Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Все указанные выше типы клеточных культур пригодны для постановки опытов нейтрализации аденовирусов. В качестве примера приведем описанную Хиллеманом и Вернером (1954) методику постановки реакции нейтрализации с парными сыворотками реконвалесцентов после заболеваний, вызванных аденовирусами. Были использозаны клетки HeLa, выращиваемые на среде следующего состава: смесь сыворотки человека—25 частей: куриный эмбриональный экстракт, состоящий из 2 частей 50% куриного эмбрионального экстракта и 5 частей ультрафильтрата 50% куриного эмбрионального экстракта — 7 частей; раствор Хэнкса — куриного эмбрионального экстракта —7 частей; раствор Хэнкса— 68 частей; пенициллин и стрептомицин в конечной концентрации— 50 ЕД/мл.
После удаления из готовых пробирочных культур среды, содержащей сыворотку человека, клетки трижды отмывают 5% раствором куриной сыворотки в растворе Хэнкса с антибиотиками. Затем в пробирки вносят по 0,6 мл среды для поддержания жизнеспособности клеток, состоящей из 10 частей смеси куриных сыво-
роток и 5 частей 50% ультрафильтрата куриного эмбрионального экстракта и 85 частей раствора Хэнкса.
Приготовляют 4-кратные разведения сыворотки больного, которую инактивировали в течение 30 минут при 56е. К 0,15 мл каждого разведения сыворотки прибавляют 0,3 мл аденовируса, содержащие 10 ТЦД50. Смеси инкубируют в течение 30 минут при 36°, после чего по 0,15 мл инокулируют в 2 пробирки. Культуры наблюдают в течение 2—3 дней до наступления полной дегенерации в контрольных пробирках, в которые инокулирован вирус без сыворотки. За титр сыворотки принимают то предельное ее разведение, которое полностью подавляет цитопатогенное действие вируса. В опыт включают контроль используемой дозы вируса. Сыворотки острого периода и периода реконвалесценции испытывают одномоментно.
Вирус кори
Методы количественного определения вируса кори и антител к нему в культуре ткани успешно стали разрабатываться только после установления Эндерсом и Пиблзом в 1954 г. (Enders, Peebles) возможности выделения и культивирования этого агента в однослойных культурах почечных клеток человека. Одновременно было установлено, что для этих целей вполне пригодны также однослойные культуры почечного эпителия обезьяны макаки-резус и макаки-циномольгус. Титрование вируса кори в культурах чувствительных клеток основывается на своеобразных изменениях, вызываемых этим агентом и впервые описанных Эндерсом и Пиблзом. Сначала в зараженных культурах появляются отдельные участки различной формы и размеров, в пределах которых связи между отдельными клетками утрачиваются, а ядра с трудом различаются. Вследствие этих изменений такие участки приобретают характерный «стекловидный» вид. Участки указанной дегенерации называются синцитиями, или симпластами (нередко их обозначают также как гигантские клетки). Часто симпласты имеют как бы ячеистую структуру, обусловленную появлением многочисленных вакуолей. По мере увеличения сроков инкубации зараженных культур размеры симпластов медленно увеличиваются. Спустя 3 недели поражается основная масса клеток, образующих пласт, однако местами еще остаются группы обособленных клеток веретенообразной формы. Заключительным этапом цитопатогенного действия является полное разрушение и распад клеточного пласта.
На окрашенных препаратах в симиластах можно наблюдать множество ядер, число которых колеблется от 40 до 100. Через несколько дней после образования симпластов в большинстве ядер можно видеть эозинофильные внутриядерные включения. В цитоплазме также встречаются массы эозинофильного материала, имеющие неправильную форму [Эндерс, Пиблз и др. (Enders,
If 1 .1 J ЛГ*7\1
В дальнейшем было показано, что к вирусу кори чувствительны также другие культуры клеток человека, как первичные, так и перевиваемые: первичные культуры амниотических клеток чело-века, приготовленные по методу Цицера, Фох, Дюннебак, перевиваемые клетки раковых линий КВ, HeLa, Нер-2, Дейтрот-6 (Эндерс, Пиблз и др., 1957), перевиваемые клетки «нормального'» происхождения: перевиваемые клетки селезенки морской свинки (Макколи, Стенфилд, Филпс, 1959), перевиваемые почечные клетки взрослого барана (В. И. Гаврилов, 1960), перевиваемые клетки сердечной ткани куриного эмбриона [Прамер, Салливен (Prior, Sullivan, 1959], перевиваемые клетки амниона человека [Френкель, Вест (FranKel, West, 1958)]. Кроме того, Езирус кори размножается и вызывает дегенеративные изменения в ряде первичных культур клеток животных неприматов: легких куриного эмбриона, почечных клеток пятинедельного хомячка, почечных клеток морской свинки, почечных клеток мыши [Райт (Wright, 1957)], почечных клеток коровьего эмбриона [Шварц, Цирбел (Schwarz, Zirhel, 1959)].
Необходимо отметить, что характер цитопатогенного действия вируса кори в культурах указанных выше типов в основном остается одним и тем же. Как правило, наиболее заметным проявлением дегенерации является образование симпластов. Для полного развития цитопатогенного действия нужны длительные сроки инкубации зараженных культур,, поэтому окончательный учет титрования вируса кори производят через 2 недели после постановки опыта.
