Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
К. Касымов (1958) разработал оригинальный метод, позволяющий регистрировать цитопатогенное действие вируса на клетки без помощи микроскопа. Пробирки с однослойными культурами
клеток почек обезьян заражают серийными разведениями вируса в количество 0,5 мл, затем в пробирки с культурами добавляют по 1 мл специальной среды. В состав ее входят: раствор Хэнкса — 89 частей; 7,5% раствор бикарбоната натрия — 4 части;
0,001% раствор нейтрального красного—1 часть; гидролизат лактальбумина— 0,5 части. В течение первых 2 суток клетки поглощают из среды нейтральный красный; при этом питательная среда становится бесцветной, а клеточный монослой окрашивается в красный цвет. При развитии цитопатогенного эффекта нейтральный красный вновь переходит в среду. О действии вируса на клетки судят по исчезновению красной полоски на стекле и появлению желтой окраски среды.
Реакция нейтрализации при исследованиях с вирусами полиомиелита применяется в двух основных модификациях. В одном случае с ее помощью производят идентификацию выделенных вирусов, в другом — ее используют для определения титров антител в сыворотках.
Титрование антител можно проводить как путем постановки реакции нейтрализации определенной дозы вируса восходящими разведениями сыворотки, так и путем постановки реакции нейтрализации последующих разведений вируса сывороткой, неразведен-ной или разведенной 1:2.
В первом случае титр сыворотки выражается ее наибольшим разведением, нейтрализовавшим вирус в 50% зараженных пробирок, а во втором случае он выражается индексом нейтрализации (отношение титра вируса в смеси с нормальной, контрольной, сывороткой к титру вируса в смеси с исследуемой сывороткой).
Обычно при титровании антител в культурах тканей используют первый метод.
Для примера рассмотрим исследования с вирусом полиомиелита.
При инденгификации вирусов полиомиелита приготовляют 1 :5 разведения специфических сывороток тина I, II и III (Мельник,
1956). Эти сыворотки должны иметь титры, превышающие 1:1000 при титровании против 100 ТЦДБи вируса. Разведенную сыворотку (0,2 мл) соединяют с таким же объемом вируса в разведении 1 :10. Пробирки встряхивают и оставляют на 1 час при комнатной температуре. Затем по 0,1 мл каждой смеси вносят в 2 пробирки с культурами, содержащими по 0,9 мл культуральной среды без сыворотки. Культуры инкубируют в стационарном положении при 37°. Учет результатов производят на 3-й и 6-й день. Типовую принадлежность вируса устанавливают по сыворотке, нейтрализовавшей его цитопатогенное действие.
При высоких титрах вируса может наступить прорыв нейтрализующего действия гомологичной сыворотки. В этом случае опыт следует повторить с меньшей дозой вируса.
Более сложной и с теоретической точки зрения недостаточно разработанной является реакция нейтрализации, применяемая для
количественного определения антител в иммунных сыворотках. Делбекко, Фогт и Стрикленд (1956) при изучении динамики нейтрализации вируса полиомиелита типа I двумя сыворотками, полученными путем иммунизации обезьян и кроликов, установили, что образование нейтрального комплекса происходит в течение короткого промежутка. По их данным, диссоциация такого комплекса ничтожна.
Однако Гард (Gard, 1957), используя иммунные сыворотки морских свинок, установил, что полная нейтрализация вируса по-лиомиелита типа I протекает очень медленно, причем скорость реакции зависит от времени и температуры. Аналогичные данные были получены Перкинсом, Пласидо, Тобиным (Perkins, Placido, Tobin, 1958). По их наблюдениям, для полной нейтрализации вируса полиомиелита иммунной сывороткой необходимо не менее 3 часов в условиях контакта при комнатной температуре. Однако полная нейтрализация вирусов типа II и III требует еще более длительного контакта — до .5Vs часов.
Большинство исследователей предлагают производить титрование антител к вирусу полиомиелита против 100 ТЦД50 вируса, поскольку с дозами в 30 ТЦДбо и меньше получаются непостоянные результаты. Лединко (Ledinko) и Мельник (1953) подробно изучили условия постановки количественной реакции нейтрализации. Воспроизводимые результаты получали в том случае, если их учитывали на 4-й день, а не на 7-й, как это обычно принято. При более длительном инкубировании наступала частичная диссоциация нейтрального комплекса вирус—антитело, в результате чего имело место искусственное занижение титров антител.
Остановимся подробнее на методике постановки реакции нейтрализации. Для примера приводим определение антител к трем типам вируса полиомиелита.
Вирусы. Рекомендуется иметь стандартные вирусы, хорошо оттитрованные в предварительных опытах и сохраняемые в замороженном состоянии. Материал хранят в ампулах или в пробирках в мелкой разливке — по 0,5—1 мл. В каждый опыт берется новая ампула.
Сыворотки, Сыворотки должны быть прогретыми при 56е в течение 30 минут. При продолжительном хранении рекомендуется их высушивать или хранить в замороженном состоянии.
Постановка реакции. Готовят двукратные разведения сывороток, начиная с I : 4 до 1 :2048 в растворе Хэнкса и разливают в три параллельных ряда пробирок по 0,5 мл. Содержимое пробирок каждого ряда смешивают соответственно с равным объемом вируса типа I, II или III, содержащим 100 ТЦДЕ0 в 0,1 мл. Пробирки со смесью вируса и сыворотки выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего инокулируют но 0,2 мл каждой смеси в 4 пробирки с растущими клетками. Затем в пробирки прибавляют по 0,8 мл питательной среды 199. Подготовка
