Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
ХРАНЕНИЕ КУЛЬТУР
При работе с культурами клеток в лабораториях может возникать необходимость в консервировании их в течение некоторого времени, в частности это может потребоваться при пересылке клеток в другие лаборатории.
Клетки млекопитающих в виде цельного органа, измельченной ткани, взвеси трипсинизированных клеток или однослойной культуры при оптимальных условиях могут сохраняться в течение различного времени.
Так, Янгнер (1954) сообщил, что жизнеспособность клеточной взвеси сохраняется по меньшей мере 2 дня (помимо дня приготовления) при содержании при 4° в среде 199 с телячьей сывороткой. Некоторые взвеси дают хорошие культуры при хранении свыше
2 недель. Клетки сохраняют свою жизнеспособность и лишь незначительное количество погибает при хранении в течение 5 днеь при 0° в 0,5% гидролизата лактальбумина в растворе Хэнксг с 4% телячьей сыворотки. Это позволяло пересылать клеточнук
взвесь самолетом из Бомбея в Ньюхавен (США) в замороженном виде.
Суим и Паркер (1955) сохраняли однослойные культуры клеток L и HeLa при 4° более 6 недель.
Шерер и Браун (1956), пересылая живые культуры клеток штамма HeLa, установили, что они легко переносят в течение
3 суток транспортировку обычной почтой.
Мельник, Раппапорт, Баукер и Бафф (1955) сообщили о возможности сохранения и пересылки взвеси трипсинизированных клеток почек обезьян до 19 дней.
Рис. 18. Динамика сохраняемости клеток при 4-6° (Ермакова, 1961).
/—цельный орган, //—измельченная ткань, ///--взвесь трип-сииизированимх клеток.
Грауфорд (Grawford, 1958) хранил взвесь трипсинизированных клеток почек обезьян при 4—6° в течение 4—5 дней.
Вопрос о сохраняемости клеток при 4—6° был подвергнут детальному исследованию М. Н. Ермаковой (1961) на модели клеток почки обезьян. Изучалась возможность сохранения ткани в виде цельного органа, измельченной на кусочки размером 2—4 мм, и в виде взвеси трипсинизированных клеток. В качестве питательной среды применяли 0,5 % гидролизат лактальбумина в растворе Хэнкса с 2% телячьей сыворотки (pH 7,1). Полученные результаты представлены на рис, 18.
Спустя 2 дня сохранялось жизнеспособными около 60% клеток. Рост клеток в приготовленных культурах был хорошим.
Клеточные взвеси, получаемые цри трипсинизации цельных органов и измельченных кусочков ткани, хранившихся 3 дня, содержали много поврежденных клеток и их обломков. Выход клеток на 1 г ткани был резко понижен, и при высеве такой культуры не удавалось получить сплошного однослойного роста. Клетки, полу-
Jft/MauSttfioSam/e, сут/ш
Рис. 19. Сохраняемость клеток, обработанных трипсином, при 4—6° (Ермакова, 1961).
/—общее число клеток, //—число жизнеспособных клеток.
е > г з 4 s s '?
Xt/tiMuStipoSjHiie. сутки
ченные при трипсинизации материала, хранившегося 4 дня, теряли способность прикрепляться к стеклу.
Как упоминалось выше, при хранении взвеси трипсинизирован-ньгх клеток ко 2-му дню сохранялось 60% клеток, а к 7-му дню их количество снижалось до 50%. При подсчете живых клеток, витально окрашенных трипановой синью, в хранившейся при 4—6° суспензии к 7-му дню оставалось лишь 32% жизнеспособных клеток. На рис. 19 представлены сравнительные данные по общему числу клеток и числу жизнеспособных клеток в трипсинизпрованной взвеси в процессе ее хранения при 4—6°.
В результате проведенных исследований М. Н. Ермакова пришла к заключению, что клетки почек обезьян могут сохраняться определенное время жизнеспособными. Наиболее продолжительный период сохраняются клетки, взвешенные в питательной среде. Без ущерба для последующего роста клеток цельные почки обезьян и измельченная почечная ткань в питательной -среде могут храниться в течение 2 дней. В обоих случаях процент погибших клеток в результате хранения одинаков. Трипсииизирован-ные клетки сохраняются до 4 дней, не утрачивая способности к хорошему росту.
Температура 4—6° является более благоприятной для сохранения трипсинизированной клеточной взвеси, чем температура 22—24°.
Существенным фактором, влияющим на сохраняемость клеток, является их концентрация во взвеси. Лучше сохраняются клетки при концентрации их в питательной среде, равной 3,5 • 105—7,5 • 105 в 1 мл (рис. 20).
При хранении взвеси трипсинизированных клеток образуются цитотоксины. Для освобождения от них Раппапорт (1956) рекомендует по истечении 10—24 часов хранения отцентрифугировать взвесь клеток и ресуспендировать ее в свежей питательной среде на остальной период хранения. Перед использованием взвесь клеток снова центрифугируют и ресуспендируют в свежей питательной среде. Эта процедура нужна для максимального выживания и роста клеток, так как свежетрипсинизированные взвеси клеток выделяют термолабильный токсин, который медленно вызывает гибель клеток при 40° и может разрушить при 37° в течение нескольких часов до 30% клеток.
Хранение клеток HeLa в суспензиях при комнатной температуре и в рефрижераторе при 4° изучили Н. Е. Гулевич и С. Я- Зал-
