Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
При глубинном культивировании всех трех клеточных штаммов наблюдались следующие фазы развития клеточной популяции:
А — начальная лаг-фаза продолжительностью 2—3 дня;
Б — фаза активного клеточного размножения, достигающая максимума в течение 9—10 дней;
В — фаза, начинающаяся примерно с 12-го дня, когда число клеток в культуре не увеличивается и они начинают гибнуть.
Отмечено, что наибольшее число клеток может быть получено путем удаления половины клеточной популяции в фазе Б; при этом каждые 3—4 дня отмечается максимальный прирост клеток в глубинных культурах.
Так, одна культура клеток МСК' в 9-литровой бутыли npi удалении половины выросших клеток каждые 3—4 дня давал; каждую 'неделю в течение 7 месяцев непрерывного культивирова ния в среднем 21,5 млн. отцентрифугированных клеток. При этоп максимальная концентрация клеток равнялась 3—5 млн. клеток ]
I мл культуральной среды. Непрерывное глубинное выращивани< этих клеток продолжалось в течение года.
Условия глубинного культивирования клеток трипсинизирован ной почечной ткани обезьян были изучены Е. М. Доссер и Б. М. До рофеевым (1961).
Культивирование производили в 1-, 3-, 5-литровых стеклянны; бутылях с ровным дном. В резиновую пробку бутыли монтирова лась короткая воздушная канюля с ватными фильтрами и длин ная, доходящая до дна сосуда, стеклянная трубка для заполнена бутыли и отбора проб. Чтобы не препятствовать движению магни та, трубку изгибали и конец ее касался дна у стенки сосуда В опытах, когда жидкости аэрировали в пробку, вводили допол нительную трубку, доходящую до дна сосуда и соединенную < системой из 3 ватных фильтров для предохранения от заражеиш микробами.
Очень важным условием для глубинного выращивания клеток как упоминалось выше, является перемешивание жидкости, кото рое должно быть непрерывным и достаточно интенсивным, чтобь поддерживать клетки во взвешенном состоянии, препятствовав их осаждению и прикреплению к стенкам сосуда и в то же врем! не вызывать механического повреждения их. Последнее особенн< опасно для клеток трипсинизированных тканей, значительно бо лее хрупких, чем клетки стабильных линий.
В опытах Е. М. Доссер и В. М. Дорофеева перемешивант осуществлялось с помощью магнитного смесителя с максимально! скоростью, не вызывающей вспенивания жидкости.
Выращивание производили в среде, применяемой обычно дл5 культивирования однослойных культур почечной ткани обезьян состоящей из 0,5% гидролизата лактальбумина в растворе Хэнкс: с добавлением 2% телячьей сыворотки, фенолового красного i антибиотиков, В среде поддерживали pH 7,1—7,3; при сдвип pH в кислую сторону в среду добавляли раствор соды; при за щелачивании среды, что иногда имело место в поздние сроки куль тивирования, производили газирование С02. В различные срою от 'начала культивирования во взвесь добавляли свежую сред; с целью доведения ее до нужного объема после взятия проб шп для повышения питательных свойств среды.
В первых опытах глубинного выращивания производилась аэра ция перемешиваемой взвеси воздухом от воздушного компрессора воздух стерилизовали системой ватных фильтров и увлажнял] пропусканием через слой воды. В последующем было установле но, что при заполнении сосуда не более чем на половину емкоси достаточная аэрация обеспечивается соприкосновением перемеши
ваемой жидкости с вышележащим слоем воздуха и, таким образом, дополнительной аэрации не требовалось.
Клетки культивировали во взвеси в термостате при 37°.
Для оценки состояния клеток из взвеси систематически отбирали пробы, в которых производилось определение pH, подсчет клеток в гемоцитометре с окраской растворами кристалвиолета и с витальным окрашиванием трипановой синью, высев клеток в пробирки и матрасы для получения стационарных однослойных культур с последующим цитологическим анализом окрашенных препаратов.
При просмотре проб во время культивирования была установлена однородность клеточной популяции, состоящей из отдельных или сдвоенных клеток. Склеивание клеток наблюдалось при нарушении режима перемешивания или при недостаточном добавлении свежей среды.
Одним из факторов, обеспечивающих успех культивирования клеток, является подбор оптимального количества их в исходном материале в начале культивирования. В отношении стационарных культур эти нормы определены. Они значительно отличаются для разного типа клеток, в частности для культивирования перевиваемых линий обычно требуются меньшие концентрации. В работах по глубинному выращиванию клеток использовали различные их количества — от 104 до 6 • 105 клеток в 1 мл. При определении оптимального исходного количества клеток трипсинизированнои почечной ткани обезьян число клеток колебалось от 4-104 до 5 • 105 в 1 мл. Оказалось, что в течение первых суток культивирования при любом количестве клеток происходило резкое снижение их числа. Это явление, отмеченное рядом исследователей [Эрл,
, Шиллинг, Бриант, Ивенс, 1954; Грэхэм, Симинович (Graham, Si-minovitch, 1955); Кюхлер, Мерчант (Kuchler, Merchant, 1956)], [¦ наблюдается при переходе клеток в лаг-фазу и связывается с тем, что клетки должны адаптироваться к питательной среде. В последующий период культивирования динамика роста клеток в различных концентрациях неодинакова.
