Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Клетки глубинных культур обоих штаммов были в общем однородными, округлой формы, с многочисленными фигурами митозов, трехполюсных делений и хромосомных мостиков.
Прямой подсчет клеток показал, что при достаточном питании в культурах определяется 95% и более живых клеток. Снижение числа живых клеток до 90% и ниже было обычно связано с недостаточным питанием или накоплением кислых продуктов жизнедеятельности клеток. Клетки в глубинных культурах на протяжении длительного времени оставались жизнеспособными. Так,
клетки штамма L в глубинных культурах в объеме 300—500 мл постоянно поддерживались в активной фазе роста более 5 месяцев. Эту культуру использовали как постоянный источник посевного материала для других исследований. Обычно каждые 2—
3 дня в ней образовывалось по 100—300 млн. клеток. Эти клетки, пересеваемые в матрасы или пробирки, давали хорошие однослойные культуры.
Клетки, выращенные в глубинных культурах, по своей морфологии и чувствительности к вирусам полиомиелита и герпеса не отличались от клеток, выращенных в однослойных культурах.
Для изучения условий глубинного выращивания в сосудах с мешалкой Денис (Danes, 1957) также использовал клетки штамма L.
В сосуды емкостью 250 мл вносили по 20 мл взвеси, содержащей 500 ООО клеток в 1 мл. Культивирование проводили при 37,5°. Клеточную взвесь перемешивали мешалкой со скоростью 230 об/мин. Культуру постоянно продували медленным током воздуха, содержащего 5% углекислоты.
Если концентрация клеток в глубинных культурах не превышала 1 300 000 в 1 мл, то поддерживался примерно логарифмический рост клеток и каждые 12 часов требовалось добавление 25 % свежей питательной среды. При таких условиях время генерации, т. е. время, которое необходимо для удвоения клеточной популяции в фазе логарифмического роста, было в среднем равно 29,8±2,7 часа. Митотический коэффициент (число делящихся клеток на 1000 клеток) был примерно равен 2,2.
В течение логарифмической фазы роста свыше 90% клеток были представлены одиночными или сдвоенными особями. Распределение клеток во взвеси на разных уровнях и различном расстоянии от центра сосуда было одинаковым.
Растущие во взвешенном состоянии клетки в течение продолжительного времени сохраняли обычные для них морфологические признаки.
Клетки, выращиваемые в глубинных культурах, при пересеве в стеклянные матрасы очень быстро 'прикреплялись и давали хороший рост.
Одной из основных трудностей, встречающихся при глубинном культивировании, является тенденция клеток к слипанию.
Образованию конгломератов способствуют такие факторы, как снижение скорости перемешиваиия, увеличение удельного веса жидкости, недостаточное питание.
Девис и др. (Davis et al., 1958) культивировали штамм FL клеток амниона человека. Глубинное .выращивание клеток проводили в сосудах, снабженных магнитными мешалками, или в небольших реакторах. Объем среды, в которой культивировали клетки, варьировал от 100 мл до 3 л. Аэрация культур достигалась пода-* чей в свободное от среды пространство сосуда сжатого, предва' рительно увлажненного воздуха. Культуру постоянно перемешивали.
Клетки, используемые для засева глубинных культур, выращивали в матрасах в питательной среде, содержащей 10% инактивированной лошадиной сыворотки и 90% среды Игла.
Глубинное выращивание клеток проводили в среде, содержащей 10% лошадиной сыворотки и 90% модифицированной среды Игла.
Состав модифицированной среды Игла
Аргинин ....... 0,021 г NaCl......... 7 г
Цистин...... 0,012 . КС1......... 0,4 ,
Гистидин.....* . 0,008 . MgS04-7Ha0..... 0,2 ,
Изолейцин ....... 0,026 , Na2HP04....... 1,44 ,
Лейцин .... ... 0.026 , --- _
Лизин . . . ...... 0,026 , Биотин ....... 1 мг
Метионин...... 0,008 „ Холин ........ * *
Фенилаланин ..... 0,016 . Фолиевая кислота . . . 1 .
Треонин ...... 0,024 , Никотинамид ....
Триптофан...... 0,004 , Пантотеновая кислота .
Тирозин ....... 0,018 „ Пиридоксаль ....
Валин ........ 0,024 „ Тиамин ....... * f
Глутамин ....... 0,300 . Рибофлавин.....
Глюкоза........ 2,5 . ---
Феноловый красный 0,01 . Антибиотики.....
(на I л среды).
Клетки штамма FL хорошо размножались в глубинных культурах. Хотя начальная концентрация равнялась лишь 166 ООО клеток в 1 мл, этого количества оказалось достаточным для глубинного культивирования. Степень размножения клеток приближалась к логарифмической кривой роста со временем генерации, равным 25—36 часам.
Клетки успешно культивировали зо взвешенном состоянии в течение 1—2 месяцев. При этом более 98% всей клеточной популяции оставалось жизнеспособной. Клетки, выращенные глубинным методом, при пересеве в матрасы или пробирки хорошо прикреплялись и образовывали сплошной слой в течение 2 дней.
Эти клетки после их глубинного выращивания полностью сохранили свою чувствительность к аденовирусу типа 4.
