Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Механический способ перевивки клеток может оказаться полезным в случае отсутствия растворов трипсина и версена.
После образования клеточного монослоя культуры можно использовать для вирусологических исследований. Предварительно
удаляют культуральную среду и заменяют ее так называемым поддерживающим раствором, не содержащим сыворотки. Такие растворы (например, среда 199) обеспечивают сохранение жизнеспособности клеток, однако не содержат белка, присутствие которого необходимо для интенсивного размножения клеток.
Следует отметить, что в некоторых случаях, когда требуется обеспечить сохранение морфологической и физиологической стабильности культур в течение более продолжительного времени, в состав среды вводят до 10% сыворотки (лошадиной или бычьей). Однако включение сывороточного компонента в состав среды обычно крайне нежелательно ввиду существования сывороточных ингибиторов размножения вирусов. Имеются прямые указания на то, что чем выше содержание сыворотки в среде для культивирования, тем больше выражено подавление размножения вируса при последующем использовании культур для постановки вирусологических опытов, хотя бы при этом использовался поддерживающий раствор, не содержащий сыворотки. По наблюдениям Халла (Hull,
1957), при наличии в среде 20—30% сыворотки промывание клеточного слоя перед инокуляцией не устраняло ингибиторов. В этом случае ингибиторы сохранялись на протяжении трех генераций клеток.
Описанная выше техника выращивания перевиваемых клеток на стекле в общих чертах повторяется в работах различных авторов, меняются лишь детали. Так, нередко для снятия клеток со стекла используют 0,1—0,25% растворы трипсина в фосфатном буфере Делбекко и Фогт. При этом ввиду высокой переваривающей активности трипсина процесс часто проводят при комнатной температуре. Иногда для снятия клеток пользуются механическими приемами (соскабливание лопатками из нержавеющей стали, резиновыми палочками, в некоторых случаях — отделение клеток с помощью сильной струи культуральной среды из пипетки).
Стремление увеличить площадь поверхности, на которой прикрепляются и размножаются клетки, побудило исследователей разработать методы культивирования клеток на твердой губчатой основе [Лейтон (Leighton, 1951)], стеклянной шерсти [Фриш (Frisch, 1952)], коллагене [Борнштейн (Bornstein, 1958); Эрман, Гей (Ehrmann, Gey, 1956)] и на стеклянных спиралях (Эрл, Шиллинг и др., 1954). Новым многообещающим методом массового выращивания* клеток является способ культивирования во взвешенном состоянии.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК В СВОБОДНО СУСПЕНДИРОВАННОМ СОСТОЯНИИ
Важным вкладом в развитие техники культивирования клеток in vitro явилось открытие Оуенса с сотрудниками (1953) способности клеток размножаться в жидкой среде в свободно суспендированном состоянии. Это открытие опровергло существовавшее
ранее мнение, что для размножения клеток in vitro необходима опора и прикрепление твердому веществу. Исследователи показали, что клетки штамма L активно размножаются в быстро вращающихся пробирках. При этих условиях среда в пробирках находится в постоянном движении, а клетки во взвешенном состоянии. В среде, содержащей буферный солевой раствор, экстракт коровьего эмбриона и сыворотку человека, через 3 дня после начала культивирования наблюдалось 3—5-кратное увеличение числа клеток. Опыты длительного культивирования с серийными пересевами показали (прогрессивный рост клеток.
Эрл с сотрудниками (1956); Вестфол, Пеппере, Бриант, Шиллинг, Эрл (1958); Бриант, Шиллинг, Эрл (1958) разработали методы практического культивирования клеток животных в больших масштабах. Применяя литровые флаконы со специальными мешалками, эти исследователи успешно выращивали ряд перевиваемых клеточных штаммов и изучали характер их роста и метаболизм.
Мак Лимане и др. (McLimans et al., 1957) .выращивали во взвешенном состоянии (так называемое глубинное культивирование) клетки HeLa и L. Глубинное культивирование проводили в сосудах, снабженных магнитными мешалками объемом от 25 мл до 5 л. В сосудах поддерживалась постоянная концентрация СОг в воздухе (5%). Позже бикарбонатный буферный раствор в питательной среде был заменен фосфатным буферным раствором. Это позволило отказаться от использования СОг. В качестве питательной среды применялся раствор Игла в 2—5-кратной концентрации. При засеве культур использовали концентрацию клеток, равную 100 000—600 000 в 1 мл. Культивирование проводили при 36°. Магнитной мешалке сообщали такую скорость вращения, чтобы в перемешиваемой культуре образовалась небольшая воронка.
Исследователи наблюдали хороший рост клеток HeLa и L. В тех случаях, когда в качестве посевного материала использовали клетки, выращенные на стекле в виде однослойных культур, логарифмический период роста клеток глубинных культур несколько задерживался. Этого не отмечалось, когда для посева использовали клетки, полученные при глубинном выращивании.
При -глубинном выращивании культуры обычно наблюдается большое количество отдельных клеток и очень малое число их представлено агрегатами по 2—4 клетки. Все клетки находятся в активном состоянии деления.
