Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Этих недостатков лишен метод Пака и Маркуса [Пак, Маркус (Puck, Marcus, 1955, 1957); Пак, Маркус, Сайкур (Ciecura, 1956)], открывающий широкие возможности выделения чистых клональных линий .из отдельных клеток перевиваемых штаммов. Принципиально метод чрезвычайно схож с методом получения изолированных колоний бактерий, например Е. coli, на чашках Петри с агаром. Однако в данном случае агар заменяет клеточный слой (в опытах авторы использовали штамм HeLa), состоящий из активно метаболизирующих клеток, утративших, однако, способность размножаться а результате воздействия рентгеновых лучей. Этот -слой — «кормилка» — обладает следующими свойствами.
1. Обогащает культуральную среду специфическими веществами, стимулирующими клеточное деление.
2. Способен нейтрализовать такие токсические агенты, как антитела, которые могут содержаться в среде.
3. Обеспечивает условия для размножения отдельных клеток, травмированных такими манипуляциями, как трипсинизация, и для образования ими 'изолированных клонов.
Необходимо отметить, что все обычные методы снятия клеток с поверхности стекла, на котором они растут, и получении клеточных взвесей, как правило, приводят к механической или химической травме клеток, лишающей их способности размножаться вне клеточной ассоциации, т. е. в тех случаях, когда для посева используется недостаточно концентрированная взвесь клеток.
Учитывая это обстоятельство, Пак и Маркус разработали максимально щадящий метод трипсинизации и получения взвесей клеток HeLa, обеспечивающий их целостность. Было показано, что такие неповрежденные клетки при высеве на поверхность чашек Петри без слоя — «кормилки», т. е. непосредственно на поверхность стекла, размножаются и образуют колонии под слоем культуральной среды, содержащей в небольшом проценте агар для придания ей вязкости. Последнее необходимо для предупреждения миграции клеток, способность к которой довольно резко выражена у штамма HeLa, так как .в противном случае получение чистых клонов стало бы невозможным (Пак, Маркус, 1956). Этот метод обеспечивает 100% клонообразование и, таким образом, позволяет проводить детальный генетический анализ популяции клеток. Клональные линии с большим правом могут называться стабильными, чем исходные родительские штаммы клеток. Сравнительное изучение чувствительности ряда выделенных клональных линий к вирусам дает возможность производить отбор тех из них,
которые® наибольшей мере отвечают конкретным задачам вирусологического исследования.
Сходный метод получения клонов опухолевых клеток во флаконах Карреля без клеточного слоя — «кормилки» — предложил У. Минь (1961). Особенности этой методики сводятся к следующему:
1) кратковременная (щадящая) трипсинизация культуры клеток;
2) разведение взвеси клеток ® 1000—10 000 раз с таким расчетом, чтобы в 1 капле содержалось не более 3—5 отдельных клеток;
3) отбор мик'рокапелек взвеси под бинокуляром с помощью стеклянных капилляров; дальнейшие манипуляции проводят лишь с капельками, содержащими по одной клетке. Такие капельки переносят в чашки Карреля Д-35, содержащие по 2 мл среды. При длительном инкубировании в среде, богатой телячьей сывороткой или сывороткой человека (20—30%), из единичных клеток образуются колонии, дающие начало клональной линии.
Накопление ряда факторов, свидетельствующих о возможности изменения некоторых свойств перевиваемых клеток при непрерывном культивировании in vitro, заставило искать способы длительной консервации клеток. Наиболее перспективным в этом плане является, очевидно, метод хранения клеток в замороженном состоянии.
Выше мы остановились на теоретических основах получения и использования в вирусологической практике штаммов (линий) перевиваемых клеток. Теперь же рассмотрим некоторые практические приемы, которыми пользуются в повседневной лабораторной практике для получения культур перевиваемых клеток.
В настоящее время наиболее распространенным способом культивирования перевиваемых клеток является метод выращивания их на поверхности стекла. Для этого пригодны различные виды лабораторной посуды, обработанные соответствующим образом. Обычно для поддержания маточных культур, т. е. для размножения клеток в больших количествах, 'пользуются матрасами различной емкости (от 100 мл до 1—2 л). Для этой цели обычно пригодны не только нейтральные, но и другие хорошие сорта стекла, не подвергающиеся значительному выщелачиванию. Для постановки опытов (выделение вирусов из патологических материалов, титрование и проведение опытов нейтрализации) приготовляют пробирочные культуры клеток.
Для отделения клеток с поверхности стекла и их диспергирования используют чаще всего 0,2% раствор версена, предложенного Цвиллингом (Zwilling, 1954). Из сосуда с клеточной культурой удаляют питательную среду, ополаскивают внутренние стенки и поверхность клеточного слоя небольшим количеством раствора версена, подогретого до 37°, после чего наливают последний в объеме, достаточном, чтобы покрыть пласт клеток. Затем сосуд с клетками помещают в термостат при 36—37°. Прикрепление кле-
