Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Анджапаридзе О.Г. -> "Культура ткани в вирусологических исследованиях" -> 35

Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.

Анджапаридзе О.Г. Культура ткани в вирусологических исследованиях — Москва, 1962. — 207 c.
Скачать (прямая ссылка): kulturarkani1962.djvu
Предыдущая << 1 .. 29 30 31 32 33 34 < 35 > 36 37 38 39 40 41 .. 101 >> Следующая

0,15% на фосфатнобуферном растворе с pH 7,0. Неочищенный высушенный папаин готовили в .виде 0,2% раствора. В качестве контроля использовался обычный раствор трипсина.
Кусочки тканей перемешивали в течение 20 минут в раствор! фермента с помощью магнитного смесителя. Надосадочную жид кость центрифугировали при 400 об/мин в течение 30 минут, а оса док клеток промывали дважды фосфатнобуферным раствором Клетки разводили питательной средой до концентрации 106 ш 1 ш
В результате проведенных опытов было установлено, чт
0,05% раствор папаина является наилучшим, так как клетки ир этом не повреждаются, а скорость освобождения клеток из кусо* кое эмбриональной ткани была такой же, как при. ее трипсинизг ции. Поскольку очищенный папаин — препарат» в 4—6 раз боле
концентрированный по сравнению с неочищенным, последний был использован в виде 0,2% раствора.
Папаинизацию проводили при pH 7,0, что является средним между значениями pH, оптимальных для папаина и клеток.
Через 16 часов после засева клеток на стекле формировалась активная однослойная культура. Различий в культурах, приготовленных из трипсинизироваиных и папаинизированных клеток, не наблюдалось. Клетки хорошо размножались и были пригодны для культивирования вируса.
Общее количество клеток, полученное при использовании неочищенного папаина, было примерно на 20% больше, чем при трипсинизации тканей.
Таким образом, папаин в очищенном и неочищенном высушенном виде может быть использован для получения клеточной взвеси из кусочков ткани с такими же результатами, как и трипсин.
Хинцем и Сивертоном (1959) для обработки ткани с целью получения однослойных культур был использован 0,01% раствор коллагеназы.
Легочные ткани кролика, свиней и человека измельчали на кусочки в 1—2 мм. Кусочки многократно промывали раствором Хэнкса для удаления эритроцитов. Ткань переносили во флаконы с магнитной мешалкой, заполненные на 30 мм раствором коллагеназы, и инкубировали в течение 10 минут на водяной бане при 37°. Затем содержимое флаконов перемешивали в течение
2 часов при 37° в термостате. После этой обработки полученные клеточные суспензии фильтровали через 4 слоя стерильной марли, осаждали центрифугированием и отделяли от надосадочной жидкости. Полученный осадок клеток 'ресуспендировали в питательной среде.
Клеточные суспензии из почки готовили таким же образом. Коллагеназа диспергировала как корковый, так и мозговой слой.
При применении тканей, наполненных кровью, обработке кол-лагеназой предшествовало перемешивание кусочков ткани с трипсином (в течение 2—10 часов при 5°. После обработки трипсином надосадочную жидкость удаляли с осевших кусочков и обрабатывали коллагеназой.
Первичная трипсинизация понижала концентрацию эритроцитов в клеточной суапензии и уменьшала размер кусочков, что облегчало более эффективное действие коллагеназы.
Клетки засевали в количестве 106 в 1 мл питательной среды.
КУЛЬТУРЫ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК
Возможности вирусологов еще более возросли после того, как была установлена адаптация некоторых типов клеток к условиям постоянного существования in vitro. Были получены клеточные штаммы, или линии, названные перевиваемыми в силу указанного выше свойства бесконечно размножаться in vitro в подходя-
ших для этого питательных средах. Определение «стабильные», которое часто употребляется в литературе как синоним понятия «перевиваемые», не вполне точно. Многие линии клеток, способные непрерывно культивироваться in vitro, обнаружили изменчивость тех или иных морфологических особенностей или биологических свойств, в том числе наиболее интересующего вирусологов, а именно чувствительности к вирусам. Даже чистые, так называемые клональные, линии клеток не вполне стабильны в своих свойствах. Это, конечно, не означает, что при определенных, точно соблюдаемых условиях культивирования нельзя добиться относительного постоянства свойств и признаков перевиваемых клеток.
Давно известно, что некоторые виды клеток можно длительное время культивировать in vitro. Полученный Каррелем еще на заре учения о культуре ткани (1913) штамм куриных фибробластов поддерживали последовательными перевивками в течение 33 лет [Паркер (Parker, I960)].
Однако подлинная история перевиваемых клеток начинается в 1943 г., когда Эрлу удалось получить непрерывно культивируемый in vitro штамм фибробластов из подкожной соединительной ткани мыши линии СЗН [Эрл и др. (Earle et al., 1943)]. Эрл в течение длительного времени культивировал эти клетки в плазменных культурах с использованием лошадиной сыворотки и куриного эмбрионального экстракта. Часть культуры в течение 1—3 месяцев подвергалась воздействию метилхолантрена. При этом клетки некоторых подштаммов постепенно утратили свойственный им первоначально характер фибробластов, приобрели округлую форму, в цитоплазме их появилась зернистость. Один из подштаммов, берущий свое начало из единственной изолированной клетки, получил название штамма L [Сэнфорд, Эрл и Лайкли (Sanford, Earle, Likely, 1948)], который нашел широкое применение в разнообразных вирусологических исследованиях. Одно перечисление последних может дать представление о той важной роли, которую сыграло в вирусологии и других дисциплинах использование перевиваемых клеток. Штамм L использовался для изучения вопросов онкогенеза [Эрл и Нэттлишип (Earle, Nettleship, 1943)], для выращивания вирусов простого герпеса и болезни Ауески (Шерер, 1953), лимфоцитарного и псевдолимфоцитарного хориоменингита (Шерер), западного [Чемберс и Ивэнс (Chambers, Evans, 1953)] и восточного [Эйринг и Шерер (Eiring, Scherer, 1955)] энцефаломиелита лошадей. В последнее время штамм L оказался удобной клеточной системой для изучения скрытого носительства клетками вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (так называемой вирогении) [Чанг (Chang, 1954)].
Предыдущая << 1 .. 29 30 31 32 33 34 < 35 > 36 37 38 39 40 41 .. 101 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed