Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Почки морских свинок . . . . 300
Тестикулы морских свинок . . . 400
Необходимо отметить, что в формировании однослойной культуры ткани, по данным Янгнера (1954), Раппапорт (1956), J1. Г. Степановой (1959), принимают участие не все клетки, внесенные в посевной дозе. Всего около 10% клеток почек обезьян обладают способностью прикрепляться к стеклу и давать в дальнейшем клеточный монослой.
Таблица б Зависимость выхода клеток от веса обезьян
Количество клеток (в млн.) при весе обезьян
Вид ткани 700-900 г X---1,5 кг 1.Е-2 кг свыше 5 кг
Почки обезьян 72 48 40 30
Е. М. Доссер, Р. И. Рапопорт, М. Н. Ермакова, И. И. Акопова, В. М. Дорофеев (1961) приводят данные (табл. 7), показывающие адгезивную способность различных клеток.
Из представленных материалов следует, что клетки взрослых животных обладают наименьшей способностью к прикреплению, чем клетки эмбриональных тканей и перевиваемых линий.
Адгезивная способность различных клеток
Культура клеток Процент ирпкреиившихен к.шток при инкубации, дни
1 2 3 4 в 6 ' 8
Почек обезьян . * * ¦ * * 8,4 2,1 2,0 0
Почек щенков собак . 3,6 6,7 6,0 5,-М 4.0 1,1 0,6 0
Почек эмбриона коровы 1,() 2,0 1.3 0
Почек эмбриона овцы . . 34,0 1,4 0 0
Почек обезьян II генерации 70,0 28,0 11,0 0
СОЦ.......... 71,0 31,0 21,0 15,0 6,0 4,0 0
HeLa .......... 49,0 18,0 13,0 4,0 0 0
Таким образом, интенсивность размножения клеток даже при одинаковых условиях выращивания различна. Но средний индекс пролиферации (отношение числа выросших клеток к числу засеянных) является относительно постоянным числом, и большие отклонения возникают при резком изменении условий культивирования (табл. 8).
Таблица 8
Индекс пролиферации различных клеток
Перевиваемые клетки Культуры и:* грииешпишрокаммий ткани
почки эморион
HeLa Нср-2 СОЦ обезьян шейков собак скипы* <>1ЩЫ
4-9 4 - 10 4-8 0,6---1,5 0,5---0,7 0,6-2,4 0,7-2,4
Метод триисинизации, предложенный Бодианом (1956). Один из серьезных недостатков метода триисинизации Янгнера заключается в сложности практического осуществления 10—15 экстракций клеток с последующим их центрифугированием и промыванием. Бодиан считает, что трата такого большого времени и усилий не обязательна. Автор добился получения хорошего выхода жизнеспособных клеток в течение 24—44 часов с помощью следующего метода.
Корковый слой почек, измельченный на кусочки в 2—4 мм, помещают в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл с 8-ю одинаковыми впадинами около основания колбы и прибавляют 150 мл 0,25% раствора трипсина Дифко. С помощью магнитной мешалки содержимое колбы перемешивают в течение 6 часов при 4° или
2 часов при 22—26°. Надосадочную жидкость удаляют, поскольку большинство токсических веществ содержится ,в этой фракции. Удаленный раствор трипсина заменяют равным количеством свежего. Ткань, взвешенную в растворе трипсина, перемешивают в течение ночи (16—20 часов) при 4°.
Клеточную взвесь собирают, центрифугируют в течение 5 минут при 600 об/мин. Клетки отмывают дважды .в растворе Хэнкса и суспендируют в среде для выращивания.
Остающиеся некоторые тканевые фрагменты могут быть обработаны тем же способом в течение 20 часов при 4° или .в течение
2 часов при 22—26°. Собранные клетки одинаково жизнеспособны и часто превышают первоначальный сбор.
Хорошие результаты были получены при использовании среды, не содержащей сыворотки. Среда состояла из 0,5% гидролизата лактальбумина, 25 мг глутамина, 10 мг DL-валина и 4 мл 30% жидкого бычьего альбумина на 1 л раствора Хэнкса.
Метод трипсинизации, описанный Даниелем и Депо (1957), является повторением метода Бодиана с некоторыми изменениями зо времени трипсинизации и обработке ткани.
Ткань очень мелко измельчают для быстрого и равномерного переваривания. Кусочки троекратно промывают фосфатнобуферным раствором с перемешиванием каждый раз по 5 минут.
Ткань помещают в колбу Фурко емкостью 125 мл, содержащую магнит. 0,25% раствор трипсина добавляют .в объеме, равном троекратному весу ткани. Колбу с тканью оставляют при комнатной температуре на 30 минут или при 4° на 4 часа. Жидкость удаляют и заменяют равным количеством свежего раствора трипсина. Колбу с тканью шомсщают на магнитную мешалку при 4° и перемешивают в течение 16 часов. Полученную клеточную суспензию фильтруют, центрифугируют. Клетки промывают 2 раза фосфатнобуферным раствором и ресуспендируют в питательной среде для роста.
Модификации, предложенные Бодианом, Даниелем и Депо, несколько упрощают процесс трипсинизации Янгнера, но они занимают 24—46 часов. С целью упрощения техники трипсинизации И. Н. Добровой (1959) была применена модификация, позволяющая в течение 2*/г—3 часов получить выход клеток в 100 млн, на
