Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
В лаборатории амниотическую оболочку отделяют от хориона, помещают в сосуд с солевым раствором с антибиотиками и отмывают от сгустков крови, слизи, обрывков ткани. После этого оболочку промывают в 3—4 сменах свежего солевого раствора.
Наилучшие результаты получаются при использовании амниотической оболочки без следов воспаления (чистой и прозрачной, как папиросная бумага), полученной от здоровых рожениц.
Подготовка куриных эмбрионов не представляет больших затруднений. Для работы отбирают 9—11-дневные живые подвиЖ' ные эмбрионы. После обработки скорлупы йодом и спиртом извлекают тело эмбриона, от туловища отделяют голову и, промыв его в солевом растворе, переносят в сосуд для измельчения.
В последние годы при исследовании различных вирусов все чаще используются культуры, приготовленные из различных органов животных — почек, тестикул и т, д.
Следует подчеркнуть, что использование животных для производства культур, на которых в дальнейшем будут накапливаться вирусы для живых или инактивированных вакцин, должно происходить только после должного карантина и тщательного ветеринарного осмотра.
Органы крупных животных — коров, овец, и свиней — извлекают обычно на бойне. Учитывая, что эта процедура проводится с минимальным соблюдением правил асептики, рекомендуют погружать полученные органы в солевой раствор с двойной концентрацией антибиотиков.
Органы лабораторных животных, и в первую очередь обезьян, извлекают с максимальными предосторожностями от загрязнения, обычно -в специально подготовленных помещениях. Предрпритель-но животное должно быть обескровлено, так как остатки крови отрицательно влияют на процесс трипсинизации. Шкуру обрабатывают 3% раствором хлорамина, после чего ее обычно удаляют. Извлекают почки в большинстве случаев со стороны спины. Операционное поле обрабатывают 5% спиртовым раствором йода, а затем обжигают спиртовым факелом.
Для извлечения почки делают разрез вдоль позвоночника в поясничной области и перпендикулярно к нему второй на уровне последнего ребра. Отделяют кожный лоскут, перерезают косую мышцу живота и делают разрез до нижнего полюса почки. Отсе-паровывают капсулу почки, захватывают орган пинцетом и перерезают сосуды и мочеточник. Извлеченную почку переносят в центрифужный стаканчик с фосфатнобуферным раствором.
Обязательным условием является проведение всех манипуляций стерильными инструментами.
При необходимости сохранить орган до следующего дня его помещают в центрифужный стаканчик с раствором лактальбуми-на, к которому добавлено 2% сыворотки. Хранят орган при 4° (Е. М. Доссер, Т. Г. Мерцлика, Р. И. Рапопорт, 1959).
Ткань, предназначаемую для приготовления культуры, измельчают ножницами или бритвой на кусочки размером I—2 мм. Большие количества ткани очень удобно измельчать ножницами в широких центрифужных стаканах. Бритвой обычно измельчают не.большие количества ткани. Для этого ткань помещают в чашку Петри, туда же добавляют несколько капель солевого раствора и лезвием безопасной бритвы, зажатым в зажим Пеана, рассекают кусочки ткани в различных направлениях до нужных размеров.
Измельченную тканевую пульпу тщательно 3—4 раза отмывают солевым раствором. Отмытые кусочки ткани готовы для дальнейшего использования, для приготовления переживающих и фик-сированных культур тканей или для трипсин из а ции с целью получения однослойных культур.
КУЛЬТУРЫ ПЕРЕЖИВАЮЩИХ ТКАНЕЙ
Методика культур переживающих тканей была разработана Мейтланд и Мейтландом (1928). В их исследованиях кусочки куриной почечной ткани, измельченной описанным выше способом, помещенные в 25—50-мл колбы Эрленмейера в среде, состоящей из раствора Тироде и куриной сыворотки, оказались хорошим субстратом для размножения вируса оеповакцины. Описанная этими авторами среда состояла из 12 мл раствора Тироде, 6 мл куриной сыворотки и 0,6 мл тканевой пульпы. Заражение культур производили в момент их приготовления. Культуры инкубировали 3—4 дня при 35—37°. Для последующих пассажей использовали либо жидкую среду, либо суспензию растертых кусочков ткани.
В дальнейшем метод приготовления переживающих культур тканей подвергался различным модификациям. Модификации эти касались главным образом состава жидкой среды.
Так, Симмс, Сандерс (1942) заменили обычную сыворотку ультрафильтрованной сывороткой. Плотц (Plotz, 1938) добавлял к среде Мейтланда и Мейтланд несколько капель куриной плазмы. При этом кусочки ткани в культуре собираются вместе в сеть из фибрина, которая в правильно приготовленных культурах стремится подняться на поверхность жидкости.
Ли и Риверс (1930) значительно упростили среду, применяя в культурах лишь один раствор Тироде.
Было показано [Эндерс, Флорман (Enders, Florman, 1942); Риверс, Хааген, Макенфусс (Rivers, Haagen, Muckenfuss, 1929)], что в этих культурах по существу имеет место лишь переживание клеток. Некоторые клетки в культурах могли переживать в течение 30 дней, а иногда наблюдалось даже и размножение отдельных клеток.
Следует отметить, что методом переживающих тканей была установлена возможность размножения вируса полиомиелита в тканях не нервного происхождения (Эндерс, Уеллер, Роббинс, 1949). Для культивирования вируса полиомиелита были использованы различные ткани человека и обезьяны. Наиболее удовлетворительные результаты получены на почечной ткани обезьяны. Среды состояли либо из смеси 75% раствора Хэнкса и 25% ультрафильтрата коровьей сыворотки, либо из среды 199. Наибольшая концентрация вируса в питательной среде культуры наблюдалась между 8-м и 12-м днем инкубации.
