Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
19. Из каждой заполненной бутыли стерильно отбирают проб; (50—70 мл), нейтрализуют 8% раствором бикарбоната и произ водят посев на сахарный и мартеновский бульон, среду Сабур! и на агар-агар. Контроль на стерильность учитывают на 9-й ден и при отсутствии роста на посевах концентрат считают стерильныл
20. Бутыли с концентратом после взятия пробы герметизирую! Концентрат можно сохранять при температуре 4—6° в течени
3 месяцев.
Изготовление рабочего разведения среды 199 из десятикратного концентрата (партия в 100 л
В стерильный резервуар из нержавеющей стали емкостью 120. вливают 90 л воды и 10 л десятикратного концентрата и хорош-перемешивают электрической мешалкой. Добавляют 100 мл раст вора D—G—Р (лабильные ингредиенты) и хорошо перемешивают Затем доводят pH среды до 7,4—7,5 лри помощи 5,6% раствор, бикарбоната натрия. Раствор бикарбоната предварительно сте рилизуют 2 раза текучим паром по 30 минут при температур 100° без давления.
Концентрацию водородных ионов определяют либо по цветно! шкале с индикатором феноловым красным, либо электрометриче ским способом. Обычно для установки pH требуется 2,6—2,8 , раствора бикарбоната.
После добавления бикарбоната среду снова тщательно пере мешивают. Крышку бака устанавливают на место и плотно затя гивают болтами.
Для стерилизующей фильтрации среды должны быть подготое лены в соответствующем количестве фильтры системы Сальнике
ва из нержавеющей стали диаметром 300 мм. В фильтры заклады-¦вают пластины марки EKS-2 и стерилизуют фильтры в течение
1 часа под давлением 0,5 атм. (температура 110°).
Перед фильтрацией пластины в фильтрах промывают стерильной бидистиллироваиной водой в количестве 2,5 л на каждую пластину. Пропускная способность одной пластины при фильтрации рабочего разведения среды 199 равняется 50 л. Первые (порции фильтрата (5 л на каждую пластину) отбрасывают. Если производить промывку пластин порциями среды 199 от предыдущей серии (также 5 л на 'каждую пластину), то основная фильтруемая среда может употребляться с первых отфильтрованных литров.
Сбор фильтрата производят закрытым .путем в 5-литровые стерильные бутыли. После заполнения бутылей фильтратом производят герметизацию.
После герметизации бутыли ставят в термостат при 37° на
4 суток. На 5-е сутки визуально проверяют все бутыли и, если признаков пророста не обнаружено, всю партию готовой среды отправляют в холодильную камеру с температурой 4—6°, где и хранят.
2. Вариант среды 199. В ряде случаев рекомендуют пользоваться вариантом среды 199 более дешевым, так называемой 50% средой 199.
Состав этой среды отличается от классической среды 199 тем, что в ней сохранена та же концентрация неорганических солей, глюкозы, глутамина и фенолового 'Красного, как и в классической среде, а концентрация других ингредиентов уменьшена в 2 раза.
Для изготовления 50% среды 199 применяют тот же 1 Обратный концентрат, пак и для классической среды. Однако на 100 л берут не 10, а 5 л десятикратного концентрата и 90 л воды. Затем в раствор добавляют 5 л свежеизготовленного 10-кратного солевого раствора Хэнкса с добавлением 5 г глутамина. Весь раствор тщательно ‘перемешивают, добавляют в него 50 мл раствора D—G—Р и снова (перемешивают.
Далее устанавливают pH и производят все другие операции так же, как и для классического рабочего разведения среды 199.
Хранят среду 199 в холодильнике лри 4—6° в течение 3 месяцев.
3. Среда 858 [Хели, Фишер и Паркер (Healy, Fischer, Parker,
1955)].
В отличие от среды 199 все аминокислоты в среду 858 вводят в виде L-форм. Это повысило питательные свойства среды, что в свою очередь увеличило прирост культивируемых клеток в 9— 10 раз.
Состав среды 858.
L-Аргииин
L-Гистидин
L-Лизин
70 мг
20 »
70 »
L-Тирозин .......................... 40
L-Триптофан .................................... 10
L-Феиилаланин .................................. 25
L-Цистин .................. ................. 20
L-Метиоиин ..................................... 15
L-Серин ........................................ 25
L-Треонин ...................................... 30
L-Лейции ....................................... 60
L-Изолейцин .................................... 20
L-Балин ........................................ 25
L-Глутаминовая кислота ......................... 75
L-Аспарапшовая кислота.......................... 30
L-Аланин ....................................... 25
L-Пролин ....................................... 40
L-Оксипролин ................................... 10
L-Цистеин ......................................260
Глицин ........................................ 50
Пиридоксин .................................... 0,025
Пиридоксаль ................................... 0,025
Биотин ......................................... 0,01
Ацетат натрия .................................. 50
Г люкуронат.................................... 4,2
