Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Раствор G смешивают со 100 мл раствора D и смесь доводят водой до 200 мл.
Для получения раствора D—G—Р в 200 мл раствора D—G растворяют 2 г аденозиитрифосфата, t
Раствор D—G—Р составляют в день изготовления среды 199, к которой он должен добавляться.
Изготовление десятикратного концентрата среды 199
Концентрат изготовляют порциями по 18 л в 20-литровых бутылях. Необходимо растворять различные ингредиенты в приводимом ниже порядке, чтобы воспрепятствовать образованию нерастворимых осадков.
1. В бутыли растворяют 1440 г хлористого натрия в 3600 мл раствора В.
2. Добавляют по 540 мл растворов М и Мь
3. Добавляют 72 г хлористого калия и растворяют при перемешивании.
4. Добавляют 36 г сернокислого магния (MgSC>4 • 7НгО).
5. Растворяют 10,8 г однозамещенного фосфорнокислого калия (КН2Р04) и 10,8 г двузамещенного фосфорнокислого натрия (Na2HP04 • 2НгО) в 2 л воды.
6. Изготовленный раствор фосфатов вливают в бутыль.
7. Растворяют 180 г глюкозы приблизительно в 1 л воды, добавляя 3,6 г фенолового красного, и общий объем доводят водой до 2 л.
8. Раствор глюкозы и фенолового красного переливают в основную бутыль.
9. Растворяют 25,2 г безводного хлористого кальция приблизительно в 3 л воды.
10. Полученный раствор хлористого кальция медленно и с энергичным перемешиванием вливают в бутыль.
11. Добавляют следующие количества основных растворов С, Е, F, Н — К, I, J. N, О rr Q в бутыль (обший объем добавленных растворов 396 мл).
Объем
Раствор в мл
С .............................36
Е .............................18
F .............................18
Н- К ..........................90
I ............18
J ............18
N ....................... . . 90
О ......................... 90
Q ............18
12. Добавляют 200 мл раствора L. Если в этом растворе выпал сульфат аденина, его предварительно растворяют .путем легкого подогревания.
13. Доводят объем раствора в бутыли приблизительно до 17 л.
14. Добавляют в бутыль аминокислоты, глутамин и ацетат
натрия,
L-Аргинин-моиогидрохлорид ........................12,6 г
L-Гистидин-моногндрохлорид .................... 3,6 »
L-Лизин-моногидрохлорид ..........................12,6 »
DL-Триптофан ..................................... 3,6 »
DL-Фенилаланин ................................... 9,0 »
DL-Метионин ...................................... 5,4 »
DL-Серин ......................................... 9,0 »
DL-Треонин ............... ..............10,8 »
DL-Изолейцин .....................................7,2 »
DL-Лейцин ........................................21,6 »
DL-Валин .............. ........................ 9,01 >
DL-Глутаминоиая кислота (ионопгдрат) .............27,0 »
DL-Аспарагиновая кислота .........................10,8»
DL-a-Аланин ...................................... 9,0 »
L-Пролин .........................................1 7,2 »
L-Оксипролин ..................................... 1,8 »
L-Глицин ......................................... 9,0 >
L-Глутамии ........................................ 18,0 »
Натрий уксуснокислый .......................... 9,0 »
15. После тщательного перемешивания полученного раствора бутыль помещают в холодильник на ночь. В течение этого времени нерастворившиеся частицы (главным образом лейцина и изолейцина) постепенно переходят в раствор.
16. На другой день конечный объем концентрата доводят водой до 18 л и хорошо перемешивают.
17. Полученный концентрат переливают в стерильный резервуар из нержавеющей стали. Обычно готовят 4 порции концентрата по 18 л, т. е. всего 72 л.
18. В резервуаре создают давление и стерилизуют концентрат, пропуская его через однорамный фильтр системы Сальникова диаметром 300 мм.
Фильтр заряжают пластинами марки EKS-2 и стерилизуют ав токлавированием под давлением 0,5 атм. (температура 110°) J течение 1 часа.
Перед фильтрацией через фильтры пропускают 2,5 л дистилли рованной в стекле стерильной воды на каждую пластину.
Профильтрованный концентрат из фильтра закрытым способог собирают в стерильные бутыли из нейтрального стекла. Бутыл! для приема фильтрата должны быть подготовлены -следующт образом.
В хорошо пригнанные к горлышкам бутылей резиновые проб ки монтируют сливную и воздушную стеклянные трубки. Н. выходной конец сливной трубки надевают резиновую трубку, свс бодный конец которой закрывают запаянной пастеровской пипет кой. На свободный конец воздушной трубки монтируют на ре зиновой трубке последовательно 2 ватных шарика фильтра (обыч ного бактериологического типа), на входной конец фильтр, надевают резиновую трубку длиной 500—600 мм. Бутыли стери лизуют в автоклаве .под давлением 0,5 атм. (температура 110° в течение 1 часа.
