Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
2 нг. Проявления перегрузки (размывание полосы по дорожке) возникают
при нанесении более 200 нг ДНК на зону шириной 0,5 см. Аналогичный эффект
может проявиться, если перед нанесением на гель ДНК неполностью
растворилась.
*) Если нуклеиновую кислоту фракционируют в отсутствие БЭ, окрашивание
можно провести после электрофореза, поместив гель на 30 мин в раствор,
содержащий 5 мкг/мл БЭ. Для снижения фонового свечения, вызванного
присутствием несвязавшегося БЭ, следует промыть гель в течение 30 мин в
буфере для электрофореза или в дистиллированной воде. Примечание:
длительная промывка может привести к исчезновению слабых зон.
'*> Во избежание повреждения ДНК, вызываемого "фотосшивкамн", следует
сфотографировать гель н далее производить вычисления н расчеты,
основываясь на снимках, а не рассматривать гель, лежащий на включенном
хемископе.
Гель может быть вновь помещен в аппарат для дальнейшего
электрофореза'.
1 Для этого гель следует окрашивать в растворе БЭ в однократном
буфе-
ре для электрофореза, а не в воде. - Прим. ред. пер.
Анализ ДНК путем рестрикции и гибридизации по Саузерну
Ш
5.4. Блоттинг по Саузерну обработанных рестриктазами и разделенных
фрагментов ДНК
5.4.1. Общие положения
После того как обработанная рестриктазами ДНК разделена путем
электрофореза в агарозном геле, следующий этате заключается в переносе
(блоттинге) разделенных фрагментов-ДНК на соответствующий фильтр. Впервые
метод блоттинга описан Саузерном [7]. Незначительно видоизменив сам
метод,, ^о многих лабораториях заменили нитроцеллюлозный фильтр,
используемый в оригинальной методике, на более прочные-найлоновые
фильтры. Кроме того, что они более прочные, эти-фильтры повышают
чувствительность гибридизации и их можно использовать многократно, причем
чувствительность при* этом не снижается (см. примечание ж в разд. 5.5.3).
В любом случае ДНК необходимо вначале перенести с геля на подложку.
Фрагменты ДНК большего размера обычно переносятся неочень эффективно, и в
связи с этим ДНК частично апуринизи-руют, обрабатывая кислотой, чтобы
раздробить молекулы-ДНК на фрагменты меньших размеров [9]. Затем ДНК в
геле-денатурируют in situ, обрабатывая концентрированной щелочью, и перед
переносом нейтрализуют, чтобы не повредить, фильтр. В результате этого
процесса ДНК становится одноцепочечной. При использовании
нитроцеллюлозных, но не найло-новых фильтров это абсолютно необходимо для
закрепления ДНК и вне зависимости от типа подложки обеспечивает
эффективность гибридизации. С появлением найлоновых подложек изменился и
"традиционный" метод капиллярного переноса, разработанный Саузерном.
Данный метод в настоящее время можно заменить электропереносом, который
гораздо быстрее капиллярного (1-2 ч по сравнению с 12-16 ч), но приводит
к некоторому снижению чувствительности [4]- После переноса ДНК должна
быть "зафиксирована" на фильтре. В оригинальном методе Саузерна это
осуществляется путем прогревания нитроцеллюлозного фильтра в течение
нескольких часов-при 80°С. Для найлоновых мембран данная процедура
заменена ультрафиолетовой сшивкой, что занимает несколько минут. Сшивка
ультрафиолетом главным образом приводит к повышению чувствительности
найлоновых фильтров, а также повышает-и чувствительность гибридизации на
обычной нитроцеллюлозе-[4]. К сожалению, на практике эта стадия вызывает
некоторые затруднения, поскольку неизвестно, какая доза ультрафиолетового
облучения требуется для каждого из известных в настоящее время типов
найлоновых фильтров. В связи с этим в*
•288
Глава 5
методику включена стадия эмпирической калибровки имеющегося в наличии
источника ультрафиолета для каждого вида "фильтра.
5.4.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [I]).
- Пластмассовая коробка (Steward Plastics). Гель должен помещаться в
эту коробку и иметь возможность незначительно перемещаться в ней.
- Покачиваемая платформа или качалка с круговым вращением.
- Плоская губка из целлюлозы (например, губка для пола Addis размером
21X14X3,5 см).
- Пластмассовая кювета (33x23x5 см).
- Бумажные полотенца (пачка толщиной 5-10 см).
- Груз (наполненный водой медицинский матрас объемом 500 мл).
- Маленькая жесткая пластмассовая крышка от коробки (Steward Plastics).
- Бумага Whatman 3 ММ.
- Найлоновый фильтр для гибридизации типа Hybond (Amer-sham).
- Тонкая полимерная пленка типа Saran Wrap (Dow Chemical Company).
.Растворы
- 5M NaCI. Растворяют 292,2 г в 750 мл дистиллированной Н20 и доводят
до 1 л.
- 2 М трис-НС1, pH 7,6. На 1 литр: растворяют 242,0 г в
800 мл дистиллированной НЮ и доводят до требуемого pH
концентрированной НС1 с помощью электрода для трис-бу-•феров (Sigma).
Доливают до 1 л дистиллированной НгО.
- 20XSSC (3,0 М NaCI; 0,3 М цитрат натрия, pH 7,0).
На 10 литров:
NaCI 1753,0 г
