Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
4) Колонку промывают натрийфосфатным-ЫаСЬбуфером (pH 7,2) до поглощения промывных вод при 280 нм <0,01.
5) Пропускают через колонку 3,5 M тиоцианат натрия (30 мл) при скорости потока 15—30 мл/ч.
6) Собирают фракции, содержащие белок, и проводят диализ против натрийфосфатного-NaCl буфера до отрицательной реакции на тиоцианат (для контроля на тиоцианат: 1 мл элюа-та + 0,1 мл 1,0 M НС1 + 0.05 мл 4,5% FeCl3 в 0,02 M HCl).
7) Для концентрирования раствора после диализа используют ультрафильтрацию или вакуумный диализ. Для концентрирования раствора объемом 30—50 мл до 1 мл с помощью вакуумного диализа требуется 24 ч; тем не менее этот метод дает высокие выходы очищенных антител.
8) Продукт хранят при —2O0C
9) Для характеристики чистоты и количественного определения антител используют один из следующих методов:
а) иммунодиффузионный метод Оухтерлони;
б) иммуноэлектрофорез по Грабарю — Вильямсу;
в) электрофорез в плоском слое (изоэлектрическое фокусирование).
2.3. а2-Макроглобулин, связанный с носителем
а2-Макроглобулин обладает высоким сродством к ионам Zn2+, поэтому белок может быть связан с агарозным носителем через хелатный комплекс с цинком [3]. С использованием аг-макроглобулина можно удалить из растворов почти все известные эндопротеиназы, включая карбокси-, тиоловые, серино-вые и металлопротеиназы. Такой адсорбент удобен для удаления в одну стадию большинства примесных протеиназ, например из неочищенных экстрактов, растворов ферментов или среды клеточных культур.
2.4. Иммобилизация уреазы на найлоне
1) Внутреннюю поверхность трубки длиной 2 м из найлона типа 6 (внутренний диаметр 0,1 см) частично гидролизуют, пропуская 3,0 M HCl в течение 60 мин при 30 °С со скоростью потока 2 мл/мин.
2) Для прекращения гидролиза трубку промывают водой, а затем обрабатывают 2,5%-ным (об./об.) раствором глутаро-вого альдегида в бикарбонатном буфере (pH 9,4) при 00C со скоростью потока 2 мл/мин,
3) Трубку промывают фосфатным буфером (pH 8,0), содержащим 1 мМ ЭДТА, при 0 °С, а затем заливают на 30 мин при O0C 7,5%-ным (масс/об.) раствором уреазы в фосфатном бу-
но
Глава 5
фере, содержащем ЭДТА (1 ммоль/л) и меркаптоэтанол (10 ммоль/л).
4) Для удаления нековалентно связанного фермента внутреннюю поверхность трубки обрабатывают поочередно 0,1 M NaHCO3, 1,0 M NaCl и водой. 1
5) Хранят трубку при 4 °С в воде до использования.
По этой методике присоединяется —62,5 мкг белка на 1 м длины трубки.
2.5. Иммобилизация пепсина
2.5.L Иммобилизация на гелях сферой. После активации бром-цианом к гидроксиалкилметакрилатным гелям типа сферой присоединяют по методике Куатреказаса [5] 1,6-диаминогексан или е-аминокапроновую кислоту. Полученные таким образом производные обозначены как NH2^epoH и СООН-сферон.
1) 4,8 мл NH2-cфepoнa или СООН-сферона суспендируют в 15 мл 0,1 M ацетата натрия (pH 4,0), содержащего 300 мг пепсина.
2) После перемешивания к каждой порции адсорбента добавляют в течение 5 мин 100 мг хлорогидрата ^этил-№-(3-ди-метиламинопропил) карбодиимида и продолжают перемешивание на магнитной мешалке при 4 °С.
3) Через 22 ч жидкую фазу с обоих образцов сливают; промывают несколько раз 0,1 M ацетатом натрия (pH 4,1), содержащим 1,0 M хлорид натрия, переносят сорбенты в колонки и последовательно промывают этим же буфером и 3,0 M мочевиной (pH 3,0).
4) В заключение промывают гели 0,01 M ацетатом натрия (pH 4,1) и 0,1 M уксусной кислотой и хранят во влажном состоянии после фильтрования при 4 °С.
Количество присоединенного фермента может быть определено по количеству кислых и нейтральных аминокислот в гидро-лизате после кислотного гидролиза высушенных гелей.
2.5.2. Получение пепсина, иммобилизованного на стекле. Частицы стекла (содержащие 96% диоксида кремния, средний диаметр пор 550 мкм, размер частиц 40—60 меш) силанизируют 7-аминопропилтриэтоксисиланом [6]. Полученное алкиламино-силан-стекло промывают ацетоном и сушат на воздухе.
Приведем методику присоединения пепсина к аминостеклу.
1) 1 г стекла суспендируют в 10 мл воды, содержащей 50 мг пепсина.
2) Добавляют 40 мг метил-я-толуолсульфоната 1-циклогек-сил-3-(2-морфолиноэтил) карбодиимида, доводят pH до 4,0 (и поддерживают это значение pH) с помощью HCl (добавляют в течение 30 мин) при комнатной температуре.
Лиганды для иммобилизации
141
3) Реакцию продолжают при 6 °С в течение ночи, затем от-еляют сорбент путем фильтрования, тщательно промывают ,01 M HCl и хранят во влажном (отжатом на фильтре) виде ри 4 °С.
2.5.3. Иммобилизация пепсина на агарозе.
1) Получение носителя. Поперечно-сшитую агарозу (200 мг сухого носителя) активируют CNBr и вводят в реакцию с 100 мг л-фенилендиамина или 25 мг 4,4/-метилендианилина в 10 мл 0,1 M NaHCO3. Через реакционную смесь в течение 15 мин пропускают азот и проводят реакцию в медленно вращающейся закрытой колбе в течение 16 ч в темноте при комнатной температуре. Промывают полимер в колонке следующими буферами:
0,1 M натрийборатным буфером с 1,0 M NaCl (pH 8,5; 24 ч); 0,1 M натрийацетатным буфером с 1,0 M NaCl (pH 4,5; 24 ч); 0,01 M натрийацетатным буфером (pH 4,5; 24 ч) и в заключение дистиллированной водой (4 ч). Хранят полимер в 0,01 M ацетатном буфере, содержащем NaN3 (0,02% масс/об.).
